李 軍，禤雄標(biāo)，謝宇舟，謝永平，彭 昊，陳澤祥，胡 帥，馬春霞，楊 威，許力干，潘 艷

大腸桿菌O157∶H7（E.coliOl57：H7）是一種與公共衛(wèi)生密切相關(guān)的腸出血性大腸桿菌血清型，感染后可引起動(dòng)物腹瀉、出血性結(jié)腸炎，溶血性尿毒綜合癥及血栓性血小板減少等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。1982年大腸桿菌O157∶H7在美國(guó)首次被確認(rèn)為食物中毒新型致病菌，現(xiàn)已成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，引起全世界廣泛的關(guān)注［1］。1986年我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)由大腸桿菌O157∶H7引起的散發(fā)感染，隨后的檢測(cè)表明該菌廣泛地分布于我國(guó)各地區(qū)［2－4］。大腸桿菌O157∶H7作為一種人獸共患病原菌，可以在畜禽中流行和傳播，并通過(guò)動(dòng)物源性食品傳染給人，目前已有眾多種動(dòng)物和動(dòng)物源性食品分離出大腸桿菌 O157∶H7的報(bào)道［5－6］。王紅等（2005）［7］在2002－2004年對(duì)廣西食品中大腸桿菌O157∶H7的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示從市售生牛肉和生豬肉中檢測(cè)到大腸桿菌O157∶H7。廣西是農(nóng)業(yè)大省，省內(nèi)有較多的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)畜禽大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解其致病性和耐藥情況，有助于控制大腸桿菌O157∶H7在畜禽中的流行和傳播，防止其經(jīng)動(dòng)物源性食品在人間傳播。為此，本研究對(duì)廣西13個(gè)市41個(gè)縣（區(qū)）200多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7流行病學(xué)調(diào)查，采集2 915份樣本進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定和生物學(xué)特性研究，獲得的廣西大腸桿菌O157∶H7流行病學(xué)信息將對(duì)預(yù)防和控制廣西大腸桿菌O157∶H7在畜禽中的流行和傳播具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，新生霉素EC肉湯、O157顯色培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州安圖生物工程有限公司，兔血瓊脂培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自制。O157和H7單因子血清購(gòu)自浙江寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。PCRTaqMix、DNA Marker 1購(gòu)自廣東東盛生物科技有限公司；微量生化鑒定管和藥物敏感試驗(yàn)紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR儀購(gòu)自日本Ta KaRa公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Inotech公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明小白鼠（20 g/只左右），購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查方法 2007年1月至2010年9月，對(duì)廣西南寧、桂林、賀州、柳州、梧州、來(lái)賓、玉林、貴港、欽州、防城港市、北海、河池、崇左13個(gè)市41個(gè)縣（區(qū)）200多個(gè)養(yǎng)豬、養(yǎng)雞、養(yǎng)鴨場(chǎng)和養(yǎng)牛場(chǎng)采取詢(xún)問(wèn)、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、臨床觀察、實(shí)驗(yàn)室檢查和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等方法，進(jìn)行畜禽大腸桿菌O157∶H7的流行病學(xué)調(diào)查。共采集畜禽糞便樣本2 915份，其中豬985份，雞772份，鴨718份，牛440份。

1.2.2 細(xì)菌分離 將采集的畜禽糞便樣本用無(wú)菌PBS稀釋?zhuān)?00 r/min離心5 min，取上清接種于新生霉素EC肉湯，37℃培養(yǎng)6 h后劃線接種到O157顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h。

1.2.3 細(xì)菌形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察 取O157顯色培養(yǎng)基37℃18 h培養(yǎng)形成的紫色菌落涂片，革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。同時(shí)將該菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯、兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察其培養(yǎng)特性。

1.2.4 生化特性 將細(xì)菌接種于微量生化管內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)菌的生化特性檢測(cè)。

1.2.5 血清型鑒定 應(yīng)用O157和H7單因子血清與待檢細(xì)菌在玻片上進(jìn)行凝集反應(yīng)，測(cè)定細(xì)菌的血清型。

1.2.6 大腸桿菌O157∶H7的PCR鑒定 采用大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法對(duì)待檢細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定待檢細(xì)菌是否有rfb E（O157）和Flic（H7）基因。引物序列為rfb E－F：5′－TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG－3′；rfb E－R：5′－CCT ATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC－3′和Flic－F：5′－GCG AAG TTA AAC ACC ACG AC－3′；Flic－R：5′－ACC CGT ACC AGC AGT AGA TT－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為291 bp和180 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.7 致病性試驗(yàn) 18只健康小白鼠隨機(jī)分成6組，每組3只。分離的大腸桿菌O157∶H7在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×1010CFU/m L。試驗(yàn)組小白鼠腹腔注射相應(yīng)分離株的菌懸液，每只0.3 m L；對(duì)照組小白鼠腹腔注射滅菌生理鹽水，每只0.3 m L。每天觀察記錄小白鼠發(fā)病和死亡情況，取死亡小白鼠心、肝和脾等組織作細(xì)菌分離鑒定。連續(xù)觀察6 d，第7 d對(duì)未死小白鼠進(jìn)行解剖觀察病變情況。

1.2.8 毒力基因的檢測(cè) 針對(duì)大腸桿菌O157∶H7的4個(gè)毒力基因，溶血素基因（Hly A）、緊密黏附素基因（Eae A）、志賀樣毒素1（Stx1A）、志賀樣毒素2（Stx2A）分別合成引物［8－9］，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，觀察大腸桿菌O157∶H7分離株攜帶毒力基因的情況。1.2.9 藥物敏感試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片法，將培養(yǎng)好的菌株用生理鹽水稀釋為1×1010CFU/m L后，吸取0.1 m L菌液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片貼于平板（6張/板，相隔不少于3 cm），置于5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié) 果

2.1 廣西大腸桿菌O157∶H7流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果利用O157顯色培養(yǎng)基對(duì)采集的2 915份畜禽糞便樣本進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7的初步分離篩選，分別從3份雞樣本、20份豬樣本和1份牛樣本中分離到24株疑似大腸桿菌O157∶H7菌株，細(xì)菌的生化特性和血清凝集反應(yīng)符合大腸桿菌O157∶H7特征。應(yīng)用大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法進(jìn)行細(xì)菌的O157和H7基因鑒定，在檢測(cè)的24份疑似樣本中，有5份細(xì)菌經(jīng)PCR鑒定為大腸桿菌O157∶H7，樣本細(xì)菌分離率為0.17%。這5份細(xì)菌來(lái)自2009年7月融水縣和防城港市的小規(guī)模豬場(chǎng)腹瀉斷奶仔豬的糞便樣本。使用Flci（H）通用型引物［10］對(duì)余下的19株細(xì)菌的Flic基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明這19株細(xì)菌的血清型是O157∶H9、O157∶H19、O157∶H25和 O157∶H30。

本次大腸桿菌O157∶H7在畜禽中的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，大腸桿菌O157∶H7主要在豬流行，當(dāng)豬群健康時(shí)有可能呈隱性感染狀態(tài)，一旦豬處于應(yīng)激狀態(tài)或免疫功能下降時(shí)，該菌可大量繁殖，引起斷奶仔豬發(fā)生腹瀉。病豬臨床表現(xiàn)為突然發(fā)生腹瀉，排出灰白色漿狀、糊狀糞便，腥臭，黏膩，腹瀉次數(shù)不等，病程4～5 d，若治療不及時(shí)可導(dǎo)致死亡。剖檢尸體外表蒼白、消瘦、腸黏膜有卡他性炎癥變化，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹。本病發(fā)病季節(jié)主要在夏季。此次調(diào)查數(shù)據(jù)將為廣西獸醫(yī)公共衛(wèi)生防治大腸桿菌O157∶H7提供依據(jù)。

2.2 細(xì)菌形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察 大腸桿菌O157∶H7在O157顯色培養(yǎng)基上形成紫紅色菌落，隨著時(shí)間延長(zhǎng)菌落逐漸變?yōu)樽虾谏黄渌竽c埃希氏菌落為淡粉紅色，腸炎沙門(mén)氏菌為淡藍(lán)綠色。大腸桿菌O157∶H7在光學(xué)顯微鏡下鏡檢為兩端鈍圓的革蘭陰性桿菌；在營(yíng)養(yǎng)肉湯上無(wú)菌膜生成但試管底有粘絲狀沉淀物；在兔血瓊脂培養(yǎng)基上形成白色菌落，中等大小、圓形、稍突起、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊，無(wú)溶血；在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落；在山梨醇麥康凱培養(yǎng)基上形成白色半透明菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成呈黑色帶金屬光澤菌落。

2.3 生化特性 將純化的細(xì)菌接種于微量生化管（杭州天和微生物試劑有限公司）內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24 h，細(xì)菌的各項(xiàng)生化結(jié)果見(jiàn)表1，與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的大腸桿菌O157∶H7的生化特性相符合［11］。

表1 大腸桿菌O157：H7廣西分離株的生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi

2.4 血清型鑒定 挑取O157顯色培養(yǎng)基上紫色菌落與大腸桿菌O157和H7單因子血清在玻片上進(jìn)行凝集反應(yīng)，凝集效價(jià)在“＋＋＋”以上的菌落共有24株，將這24株細(xì)菌繼續(xù)純化培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定。

2.5 大腸桿菌O157∶H7的基因鑒定 應(yīng)用大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定，確定細(xì)菌是否有rfb E（O157）和Flic（H7）基因。PCR產(chǎn)物電泳顯示在檢測(cè)的24份疑似大腸桿菌O157∶H7的DNA中有5份細(xì)菌DNA擴(kuò)增出291 bp和180 bp的目的片段（圖1），表明這5份疑似大腸桿菌O157∶H7細(xì)菌含有O157和H7基因，證實(shí)為大腸桿菌O157∶H7。

2.6 大腸桿菌O157∶H7分離株的致病性試驗(yàn)攻毒6 h后，大部分小白鼠精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、呼吸困難，對(duì)刺激反應(yīng)降低。12 h后FC1和RS1菌株引起全部小白鼠死亡，死亡率100%。其余3株細(xì)菌在24 h內(nèi)引起部分小白鼠死亡，RS2和FC3菌株對(duì)小白鼠的死亡率為66.7%；FC2菌株對(duì)小白鼠的死亡率為33.4%。死亡小白鼠病理變化為腸壁菲薄，出血充血、腸腔內(nèi)充滿(mǎn)黃色液體，以十二指腸病變最嚴(yán)重；肝臟、心、肺、脾和腎有少量出血點(diǎn)。取死亡小白鼠心血和脾臟劃線培養(yǎng)，均獲得原感染菌株。攻毒后第7 d，攻毒未死小鼠解剖發(fā)現(xiàn)腸壁變薄，內(nèi)含多量氣泡；肝臟表面、心、肺、脾等有不同程度的出血。對(duì)照組小白鼠在試驗(yàn)期間精神、食欲和對(duì)條件刺激反應(yīng)都無(wú)異常。

圖1 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株的雙重PCR檢測(cè)Fig.1 Results of duplex PCR assay of E.coli O157∶H7 strains isolated from GuangxiM：Marker 1；1：RS1；2：RS2；3：FC1；4：FC2；5：FC3

2.7 大腸桿菌O157∶H7分離株的毒力基因檢測(cè)5株大腸桿菌O157∶H7廣西分離株毒力基因的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，5株大腸桿菌O157∶H7攜帶的毒力基因略有差異，具體情況見(jiàn)表2。

表2 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株毒力情況Tab.2 Virulence of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi

2.8 大腸桿菌O157∶H7分離株的藥物敏感試驗(yàn)

選用氨基糖苷類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素、β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、氟喹諾酮類(lèi)藥物、磺胺類(lèi)抗菌藥、多肽類(lèi)抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、林可胺類(lèi)抗生素、氯霉素類(lèi)抗生素和利福霉素類(lèi)抗菌藥共10類(lèi)26種抗菌藥物對(duì)分離得到的5株大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

藥敏結(jié)果表明大腸桿菌O157∶H7廣西分離株對(duì)阿莫西林、氨芐西林、多粘菌素B、羅紅霉素、利福平和林可霉素不敏感；對(duì)卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等氨基糖苷類(lèi)抗生素、復(fù)方新諾明和多西環(huán)素中度敏感；對(duì)頭孢西丁、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟等β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等氟喹諾酮類(lèi)藥物、和氟苯尼考高度敏感。

3 討 論

家畜家禽是大腸桿菌O157∶H7的主要?jiǎng)游锼拗骱蛡魅驹矗?－6］，本研究對(duì)廣西985份豬樣本、772份雞樣本、718份鴨樣本和440份牛樣本進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7的細(xì)菌分離和鑒定，最終從5份斷奶腹瀉仔豬的糞便樣本中分離鑒定出大腸桿菌O157∶H7，樣本細(xì)菌分離率為0.17%。在采集的樣本中以豬的樣本最多，這可能是導(dǎo)致大腸桿菌O157∶H7都分離自豬樣本的主要原因。雖然未能從雞、鴨和牛的樣本中檢出大腸桿菌O157∶H7，但不代表廣西的雞、鴨和牛未攜帶大腸桿菌O157∶H7，在今后仍需繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)雞、鴨、牛攜帶大腸桿菌O157∶H7的監(jiān)測(cè)。

傳統(tǒng)的大腸桿菌O157∶H7分離鑒定方法是將待檢樣本接種到山梨醇麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，再挑取培養(yǎng)基上白色半透明菌落進(jìn)行O157和H7單因子血清凝集反應(yīng)。由于赫爾曼埃希菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9血清型、N群沙門(mén)氏菌、弗勞地和塞氏枸櫞酸桿菌、流產(chǎn)布魯氏菌、大腸桿菌O157非H7血清型細(xì)菌和大腸桿菌O157∶H7的菌體脂多糖的O特異性多糖都含有同樣的4－氨基－4，6雙脫氫－α－D甘露糖殘基，在使用山梨醇麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)都不能利用培養(yǎng)基的山梨醇，形成的菌落為白色，在形態(tài)上不能和大腸桿菌O157∶H7區(qū)別［12］。流產(chǎn)布魯氏菌、大腸桿菌O157非H7血清型細(xì)菌與O157∶H7存在著部分相同的抗原，在進(jìn)行單因子血清凝集試驗(yàn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)［13］，從而影響結(jié)果的判定。因此使用山梨醇麥康凱培養(yǎng)基和血清凝集反應(yīng)不能正確鑒定大腸桿菌O157∶H7，必須應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)其基因進(jìn)行鑒定。

表3 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Drug susceptibility test of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi）

表4 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株對(duì)抗菌藥物的耐藥率Tab.4 Drug resistance rate of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi

大腸桿菌的緊密黏附素介導(dǎo)大腸桿菌與宿主上皮細(xì)胞的緊密黏附，是細(xì)菌表現(xiàn)其毒性所必需的［14］。志賀樣毒素分為志賀樣毒素1和志賀樣毒素2，它不僅有助于細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附和定植，還具有RNA N－糖苷酶作用，可特異性裂解細(xì)胞28S r RNA，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白合成受阻，腸黏膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞，引起血液釋放到腸腔。多數(shù)情況下，只產(chǎn)生志賀樣毒素2的菌株毒力較只產(chǎn)生賀樣毒素1或產(chǎn)生志賀樣毒素1和志賀樣毒素2混合型的菌株強(qiáng)［15－16］。在本研究中，有2株分離株攜帶緊密黏附素基因和志賀樣毒素2基因；有3株分離株攜帶了緊密黏附素基因、志賀樣毒素1基因和志賀樣毒素2基因。分離株對(duì)小白鼠的致病性試驗(yàn)表明分離株攜帶的毒力基因與其對(duì)小白鼠的致死率存在著一定的相關(guān)性。

本研究分離的大腸桿菌O157∶H7菌株對(duì)目前獸醫(yī)臨床上常用的一些抗菌藥物不敏感，如阿莫西林、氨芐西林、多粘菌素B、羅紅霉素、利福平和林可霉素；甚至是在同一豬場(chǎng)分離的不同菌株，對(duì)同一藥物的敏感性也有差異。分離菌株多重耐藥性的出現(xiàn)是獸醫(yī)臨床上濫用抗菌藥物的結(jié)果，由于細(xì)菌耐藥性可以水平傳播，因此，應(yīng)加強(qiáng)普及基層獸醫(yī)人員的藥物應(yīng)用知識(shí)，避免長(zhǎng)期單一使用藥物或低劑量使用，防止耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生和擴(kuò)大。

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