董 秀 韓兆峰 王曉波

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

斑蝥素，是從中藥斑蝥中提取的一種抗腫瘤活性成分，因其毒性大，影響臨床應(yīng)用。因此目前多采用去除1，2位甲基的方法合成去甲斑蝥素 (Norcantharidin，NCTD)。研究表明，去甲斑蝥素具有良好的抗腫瘤作用，能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1－3］。作者之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去甲斑蝥素能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖，本文進(jìn)一步考察了其對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，為去甲斑蝥素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，去甲斑蝥素由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。RPMI－1640培養(yǎng)液，碘化丙啶 (PI)，Sigma;二氧化碳培養(yǎng)箱 (NuAir，Plymouth，USA)，倒置顯微鏡等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞接種在含10%胎牛血清和2mmol·L－1谷氨酰胺的RPMI－1640培養(yǎng)液中，在飽和濕度，溫度為37℃，濃度為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察 將HepG2細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液的六孔板中 (密度每孔1．2×104)，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入50M的去甲斑蝥素，作用24小時(shí)后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率 收集藥物作用后的HepG2細(xì)胞，用PBS和預(yù)冷的70%乙醇于4°C固定至少12h。固定后，用PBS漂洗離心后的細(xì)胞餅，再用含50mg/L PI，1g/L RNAase的染料避光冰浴30min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，用SPSS 13．0軟件中的ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，P值小于0．05視為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 相差顯微鏡下觀察到，50M去甲斑蝥素作用24小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài) (包括細(xì)胞膜皺縮、變圓，核碎裂和凋亡小體的形成)，而對(duì)照組的細(xì)胞正常生長(zhǎng)，未見明顯凋亡形態(tài)。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡的比率 去甲斑蝥素作用24小時(shí)后，凋亡細(xì)胞所占比例增加 (28.62%)，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無明顯改變 (2.26%)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異。

4 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，多數(shù)患者需面對(duì)生存率低，生活質(zhì)量差，醫(yī)療費(fèi)用昂貴的問題。尋找高效、低毒、廉價(jià)的化療藥物，是醫(yī)藥工作者的重要任務(wù)。抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡成為治療腫瘤的重要方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去甲斑蝥素能抑制HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示了去甲斑蝥素在肝癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。

［1］李柏，凌昌全．去甲斑蝥素基礎(chǔ)及臨床研究進(jìn)展［J］．中草藥．2002，33(2):184－185．

［2］原江亮．去甲斑蝥素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系作用的研究現(xiàn)狀［J］．長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，22(4):305－307．

［3］ Yang P Y，Chen M F，Tsai C H，et al．Involvement of caspase and MAPK activities in Norcantharidin induced colorectal cancer cell apoptosis［J］．Toxicol In Vitro，2010，24(3):7660 －775．