艾碧琛，趙國榮，賀又舜，肖碧躍

(湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是指感染或非感染因素作用于機體而引起的一種難以控制的全身性瀑布式炎癥反應綜合征，可以痊愈，也常發(fā)展成膿毒性休克和多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。引起SIRS的原因有感染性因素與非感染性因素兩個方面，其中感染性因素占70%左右，又以革蘭氏陰性細菌為主，但臨床上發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌感染使用抗革蘭陰性菌的抗生素療效不佳，于是人們開始注意到細菌產物的作用，近年研究得較多的是內毒素，即脂多糖(LPS)。LPS進入血液循環(huán)后，形成內毒素血癥，通常可導致SIRS、MODS、彌漫性血管內凝血等，病死率極高。感染性疾病是溫病學研究的主要內容，由感染因素所致的內毒素血癥，屬中醫(yī)學“溫病”范疇，中醫(yī)學認為，內毒素血癥系外感六淫，或內有郁熱，邪毒化火，蓄而成毒，熱毒內盛，邪毒內陷而成，溫病衛(wèi)、氣、營、血階段中均存在內毒素血癥［1］。葉天士創(chuàng)立的衛(wèi)氣營血辨證至今300多年，一直有效指導臨床辨證治療感染性疾病。隨著對SIRS、內毒素血癥認識的深入，以及近年中醫(yī)衛(wèi)氣營血辨證對非典型性肺炎、H1N1流感等疾病的確切防治效果，人們越來越意識到衛(wèi)氣營血辨證診療感染性疾病的有效性［2］。因此，衛(wèi)氣營血辨證防治SIRS的研究成為了溫病學的新任務。要進行此項研究，動物實驗是必不可少的研究途徑，我們首先應該在動物實驗中找到內毒素血癥與溫病衛(wèi)氣營血辨證的相關性，才能為進一步的研究提供實驗依據。

1 實驗材料的選擇

發(fā)熱是溫病的基本癥狀，兔的體溫變化十分靈敏，最易產生發(fā)熱反應，發(fā)熱反應典型、恒定，所以我們選擇兔作為模型動物，以大腸桿菌內毒素(LPS)攻毒，復制內毒素血癥模型。實驗時，我們所用的兔品種為新西蘭大耳白兔;LPS購自美國Sigma公司;血清學為O111:B4，批號118K4052。

2 確定造模方法

根據文獻報道，用LPS造內毒素血癥或膿毒癥兔模型的方法較多，如有的采用家兔耳緣靜脈一次注射足劑量 LPS 的方法［3］，也有通過上腔靜脈［4］或門靜脈［5］、頸靜脈［6］持續(xù)微量輸注 LPS 的方法，還有二次打擊造模法，即一次打擊后間隔24h后再進行二次打擊［5］等等。因為我們的實驗目的是尋求內毒素血癥與溫病衛(wèi)氣營血證候的相關性，參考文獻報道的各種造模方法，遵循復制動物模型要盡可能與人類疾病相似的原則，我們認為一次打擊更符合臨床中溫病發(fā)生的大多數(shù)情況，即感邪即發(fā)，同時也考慮到復制動物模型的易行性以及便于今后開展進一步研究的適用性，我們最終選擇耳緣靜脈一次注射LPS的方式。

關于LPS的注射劑量，因為不同血清型、或相同血清型但不同廠家生產的LPS，即使劑量相同，復制的模型在病理反應和病證特征方面也不具有良好的可重復性［7］，而且此類LPS為酚提取的LPS，該種提取方式可以造成成品中有超過60%的RNA和不超過1%的蛋白，批間差異比較大，所以即使是相同血清型不同批號的LPS，也會產生不一致的實驗結果。我們?yōu)榱藢ふ覍嶒炞詈线m的內毒素造模劑量，由小到大分別嘗試了 1μg/kg、3μg/kg、5μg/kg、10μg/kg 和 15μg/kg 等大小不同的多個劑量，發(fā)現(xiàn) 1μg/kg、3μg/kg、5μg/kg 三個劑量攻毒后，實驗兔有發(fā)熱及相關癥狀體征出現(xiàn)，但癥狀較輕，大多數(shù)很快(不超過8h)恢復正常，不利于觀察營分證和血分證，說明這幾個劑量毒力較小。于是加大劑量至 10μg/kg、15μg/kg，發(fā)現(xiàn)用 15μg/kg 的劑量攻毒后，有接近一半的實驗兔在8h內即出現(xiàn)死亡，時間太短，又不利于衛(wèi)氣營血階段性的觀察，而在10μg/kg的攻毒劑量上，實驗兔有相對較好的癥狀體征由輕到重的階段性表現(xiàn)，最后我們確定10μg/kg為實驗中內毒素血癥的造模用劑量。

3 分析內毒素血癥兔的癥狀、體征與溫病衛(wèi)氣營血證候的相似點

通過反復觀察實驗兔在LPS攻毒后的癥狀體征的變化，我們認為在10μg/kg劑量攻毒后，內毒素血癥兔出現(xiàn)了較為有規(guī)律的三個階段:第1階段(攻毒后1～2h)、第2階段(攻毒后2～6h)，第3階段(攻毒后6～36h)，并且3個階段分別與衛(wèi)、氣、營血分證候相似［8］。

3.1 第1階段癥狀、體征及其與衛(wèi)分證的相似點

實驗中第1階段模型兔體溫開始升高，心率、呼吸增快，聳毛、發(fā)抖、噴嚏，這與溫病衛(wèi)分證溫邪初襲人體肌表所致的發(fā)熱惡寒相似。因為衛(wèi)分證是溫邪初襲衛(wèi)表，邪正交爭于衛(wèi)分所致，以發(fā)熱、微惡風寒、口微渴為辨證要點。隨著時間增加，在攻毒后接近2h的時候，聳毛、發(fā)抖、噴嚏、流涕癥狀逐漸消失，體溫繼續(xù)升高，同時部分兔開始出現(xiàn)耳廓發(fā)熱、充血，類似人類溫病由衛(wèi)分逐漸傳入氣分的傳變過程。

3.2 第2階段癥狀、體征及其與氣分證的相似點

攻毒后的第2～6h內，模型兔出現(xiàn)小便黃、呼吸明顯增快增粗、心率增快，耳廓發(fā)熱、充血明顯以及結膜充血，而且攻毒后體溫升高的最高值出現(xiàn)在這個階段內，反映這個階段熱勢極盛，這與氣分證相似。溫病氣分證是感邪后，整體氣機受郁，正氣奮起抗邪，邪正劇爭，熱熾津傷，以發(fā)熱不惡寒、口渴、苔黃為主要表現(xiàn)。同時，氣分證的病位較為廣泛，涉及肺、脾、胃、腸等多臟腑，實驗中此階段有相當一部分兔出現(xiàn)了大便溏瀉、水樣便或黏液便等，這也反映病位由表入里，類似由衛(wèi)分證進入氣分證。

3.3 第3階段癥狀、體征及其與營、血分證的相似點

溫病營分證以營熱陰傷、擾神竄絡為主要特點，身熱夜甚、心煩譫語、舌質絳紅為辨證要點;血分證以動血耗血、瘀熱內阻、進而臟氣衰竭為主要病機變化，以急性多部位、多竅道出血、斑疹密布及舌質深絳為其辨證要點。在3階段即第6～36h內，模型兔體溫、呼吸、心率均比2階段略降，精神逐漸萎靡，活動度和靈敏度明顯下降，便血、耳廓發(fā)涼、結膜充血明顯，出現(xiàn)口周青紫、耳廓青紫或有瘀點瘀斑、眼球突出、鼻衄、嗜睡、全身癱軟無力、角弓反張、抽搐和死亡。這些與溫邪入營、擾神竄絡的營分證以及動血耗血、瘀熱內阻、進而臟氣衰竭的血分證相似。但是，我們的實驗未能將營分證和血分證二者從癥狀體征或時間上截然分開。在實驗中發(fā)現(xiàn)，從氣分證向營、血分傳變時，更多出現(xiàn)的是由氣分越期進入血分、或者出現(xiàn)營分證、血分證重疊，導致二者難以嚴格區(qū)分。

4 實驗兔具有較明顯的個體差異性

與臨床患者有個體差異一樣，實驗兔也有十分明顯的個體差異。如攻毒后，大部分模型兔出現(xiàn)了較為有規(guī)律的類似人類衛(wèi)、氣、營、血階段表現(xiàn)，而有些兔經過2階段(氣分證)后，并沒有接著出現(xiàn)3階段(營分證或血分證)的癥狀，而是癥狀和體征逐漸消失，又恢復到正常;還有個別兔在攻毒后2～3h仍然有聳毛、噴嚏、流涕等類似衛(wèi)分證的表現(xiàn)，這又類似于衛(wèi)氣營血辨證特殊傳變中的自愈或不傳。而有個別兔在攻毒后5h左右已出現(xiàn)便血;還有一只兔在攻毒后1.5h即出現(xiàn)抽搐而死亡，這又類似“直中肝經”。

5 內毒素血癥兔與人類衛(wèi)氣營血證候存在不同

雖然內毒素血癥兔表現(xiàn)出了許多與衛(wèi)氣營血證候相似之處，但仍然有一些不同。如在攻毒后至0.5h之間，除了體溫升高外，模型兔開始出現(xiàn)懶動、蜷臥、少飲少食等癥狀，但對人類而言，在感邪的初期，以發(fā)熱惡寒為主要表現(xiàn)，而沒有懶動、蜷臥等癥狀，少飲少食等在感邪的初期應該也并不明顯。再如，一些在溫病臨床中比較重要的衛(wèi)氣營血證辨證要點的癥狀體征，如渴飲、煩躁不安等精神方面的改變及舌象變化等，自始至終都沒有出現(xiàn)。

6 從中醫(yī)證候動物實驗學的特點來評價實驗結果

我們實驗的目的是從內毒素血癥模型中復制溫病衛(wèi)氣營血模型，采用的是病因模擬的方法，即選擇造成與臨床證型相仿的治病因素(LPS)，作用于動物機體使其產生類似臨床證候(衛(wèi)氣營血證候)的模型。但復制中醫(yī)“證”的動物模型難度較大，因為中醫(yī)“證”是疾病的病因、病位及病邪性質的概括，且臨床多以病人主觀感覺反映出來，確切的客觀指標又還沒有確定下來，所以多數(shù)學者認為，目前只有盡可能從“證”的臨床辨證標準來評價中醫(yī)“證”的動物模型［9］。但由于模型動物和人處在生物進化樹的不同層次，所以會出現(xiàn)模型動物與人對刺激的反應不同的現(xiàn)象，如整個實驗過程中模型兔的舌象變化并不明顯;而攻毒初期模型兔即出現(xiàn)懶動、蜷臥、少飲少食等較明顯的癥狀;即使是在第二階段的高熱狀態(tài)下，也沒有觀察到渴飲、煩躁不安等精神改變，更不用說心煩譫語這些癥狀了。

此外，中醫(yī)證候有相當一部分病情資料，用中醫(yī)傳統(tǒng)的望、聞、問、切診察方法在動物身上難以收集，所以模型的診斷依據應該可以作非原則性的變通［10］。如發(fā)熱，古代醫(yī)家通過縝密的臨床觀察和思辨，將衛(wèi)氣營血證不同的熱型進行定性，借以辨別各證，如衛(wèi)分證是發(fā)熱、微惡風寒并見，氣分證但熱不惡寒，營分證身熱夜甚。但是在動物實驗中，這些不同的熱型是很難表現(xiàn)出來的，不過我們發(fā)現(xiàn)體溫高低不同階段是有差異的。如實驗結果顯示，第1階段(與衛(wèi)分證相關)開始出現(xiàn)發(fā)熱，但熱勢不高;第2階段(與氣分證相關)的發(fā)熱程度為三階段中最高的，而到了第3階段(與營血分證相關)時，發(fā)熱程度又有減輕。應該說，三個階段體溫高低的動態(tài)變化，與衛(wèi)分證發(fā)熱、微惡風寒，氣分證但熱不惡寒，營分證身熱夜甚的熱型變化是有一致性的。再看，對人類來說，感邪初期的一個重要癥狀就是發(fā)熱惡寒，但惡寒是患者的自我感覺癥狀，無法在模型兔上檢測出來，就只能通過分析惡寒的基本特征，在模型兔身上找到可供診斷的證據，實驗中我們觀察到在第1階段，有部分模型兔出現(xiàn)了聳毛，應該就可以看成是惡寒的表現(xiàn)。

綜上所述，從中醫(yī)證候動物實驗學的特點來看，其對中醫(yī)證候動物模型的復制有一定的包容性，只要其表現(xiàn)和體征與“證”的臨床表現(xiàn)大致相同，能反映中醫(yī)“證”的特點，則其模型就可以認為是較為成功的［7］。所以總的來說，從癥狀和體征來看，實驗中的內毒素血癥兔模型反映出了較明顯的衛(wèi)分證、氣分證、營血分證三類證候特征，從內毒素血癥模型復制溫病衛(wèi)氣營血模型是可行的。當然，判斷建立證候模型的真實性及與臨床的一致性，還需要通過實驗室指標檢測以及治療反證等途徑來判斷，我們將在下一步的實驗中對此進行完善。

［1］楊愛東，曾蘭，屠燕捷，等.不同治法對內毒素血癥小鼠肺組織細胞因子的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34(3):358 －360.

［2］趙國榮，肖碧躍，盧岳華，等.衛(wèi)分證與氣分證、營分證IL－6、IL－10變化規(guī)律對比研究［J］.新中醫(yī)，2005，37(6):19－21.

［3］徐麗君，陸付耳，王開富，等.3種溫病治法制劑對家兔內毒素血癥治療效果的比較［J］.中國中西醫(yī)結合急救雜志，2002，9(3):132－134.

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［10］馬健.巴氏桿菌性家兔溫病氣營傳變模型建立的初步研究［J］.中國醫(yī)藥學報，1991，6(2):57－62.