于桂春， 王瀟然， 侯曉華， 周珊珊， 張黎明

目前發(fā)現(xiàn)的血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC)鉀通道主要有4種:電壓依賴(lài)性鉀通道(KV)、鈣激活鉀通道(KCa)、內(nèi)向整流鉀通道(Kir)和ATP敏感的鉀通道(KATP)。其中KCa及KV在數(shù)量上要遠(yuǎn)多于后兩者。鉀通道對(duì)于VSMC的膜電位起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，鉀內(nèi)流導(dǎo)致膜復(fù)極化，是保持靜息膜電位的主要離子流。當(dāng)VSMC膜去極化時(shí)，電壓依賴(lài)性鈣通道激活，胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)，胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高最終可導(dǎo)致血管平滑肌的收縮［1］。因此，鉀通道在血管平滑肌的舒縮和血管緊張度的維持機(jī)制中起著重要作用。鉀通道的病理生理變化表現(xiàn)在許多血管高反應(yīng)性相關(guān)的病理狀態(tài)中，如:高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化［2］、蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣［3］等。鉀通道也因而成為眾多藥物的作用靶點(diǎn)之一。酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑金雀異黃素(Genistein，GST)是一種來(lái)源于豆類(lèi)植物的異黃酮類(lèi)化合物，具有抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，預(yù)防心腦血管系統(tǒng)疾病和骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，以及弱的雌激素和抗雌激素等作用［4］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)GST對(duì)于離子通道也有快速的調(diào)節(jié)作用［5～10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)GST對(duì)急性分離大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Mesenteric arterial smooth muscle cells，MASMC)的鉀電流(IK)以及膜電位的影響，以探討GST對(duì)鉀通道的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 MASMC的制備 腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)以麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(體重150～250g)。取出腸系膜前動(dòng)脈支配的全段腸系膜，置于生理鹽溶液 (Physiological saline solution，PSS)(mmol/L;137 NaCl，5.4 KCl，0.44 NaH2PO4，0.42 Na2HPO4，4.17 NaHCO3，10 HEPES，通以 95%O2和5%CO2的混合氣體，pH值7.4)中，在體式顯微鏡下剝離出腸系膜前動(dòng)脈。將3級(jí)以下分支剪成長(zhǎng)約2mm的小段并轉(zhuǎn)移到裝有2ml分離液A(PSS中含1.5mg/ml膠原酶/分散酶，0.5mg/ml彈性蛋白酶II-a，1mg/ml胰蛋白酶抑制劑I-s，2mg/ml胎牛血清)的離心管中37℃水浴孵育40min，而后將組織移到裝有2ml分離液 B(PSS中含1mg/ml膠原酶，2mg/ml胎牛血清)的離心管中 37℃水浴孵育40min。經(jīng)Pasteur管洗脫和吹打后，細(xì)胞懸液在含1%青霉素，鏈霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)中4℃培養(yǎng)4h，而后于含10%胎牛血清的DMEM中37℃培養(yǎng)備用。

1.2 膜電流及膜電位的記錄 本實(shí)驗(yàn)全部采用全細(xì)胞膜片鉗記錄模式，在電流鉗模式下記錄膜電位，在電壓鉗模式下記錄鉀電流。全部實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行(22℃)。膜片鉗放大器為 Axopatch-1D(Axon Instruments)，通過(guò) TL-1 DMA(Axon Instruments)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，記錄軟件為pClamp，濾波為2 kHz，記錄電極電阻為3～5 MΩ。電極內(nèi)液 (mmol/L):130 KCl，10 HEPES，1 MgCl2，1 CaCl2，10 EGTA，2 Na2ATP以 KOH調(diào)節(jié) pH值為7.2。細(xì)胞外液(mmol/L):130 NaCl，5.4 KCl，1.2 MgCl2，1.8 CaCl2，10 HEPES，10 Glucose，以 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為7.4。記錄鉀電流時(shí)，鉗制電位為 －70mV，從 －80mV至 +50mV，每個(gè)刺激持續(xù) 2s，每次遞增10mV，刺激間隔為10s。

1.3 主要試劑 Genistein、Daidzein、tyrphostin25購(gòu)自Calbiochem，配置成100mmol/L的二甲基亞砜?jī)?chǔ)存液，試驗(yàn)中二甲基亞砜最終濃度小于0.1%。其他試劑購(gòu)自Sigma公司。

2 結(jié)果

2.1 GST對(duì)IK的影響 在電壓鉗模式下，方波脈沖記錄的電流可以被鉀通道阻滯劑四乙胺(Tetraethylammonium TEA)顯著抑制。從電流電壓(I-V)曲線中可以看出，在刺激電位0-+50mV的區(qū)間內(nèi)TEA(1mmol/L)可抑制記錄電流達(dá)55%～80%，I-V曲線明顯下移(P＜0.05)。TEA的抑制作用還呈現(xiàn)出快速可逆性以及濃度依賴(lài)性，表明所記錄的電流為IK。GST(100μmol/L)可以快速可逆的抑制 IK(P ＜0.05)。tyrphostin25(10μmol/L)也可抑制IK(P＜0.05)，其作用與 GST類(lèi)似，而 Daidzein(100μmol/L)對(duì) IK沒(méi)有顯著影響(P ＞0.05)。

2.2 GST對(duì)IK作用的ATP依賴(lài)性 GST和tyrphostin 25對(duì)IK抑的制作用與細(xì)胞內(nèi)的ATP密切相關(guān)。在電極內(nèi)液不含 ATP的條件下，GST(100μmol/L)和tyrphostin 25(10μmol/L)對(duì)IK的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＞0.05)。

2.3 GST對(duì)膜電位的影響 大鼠MASMC的靜息膜電位值為 －45.8±2.5mV(n=15)。TEA 能去極化膜電位，其作用呈可逆性以及濃度依賴(lài)性，0.3mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、10mmol/L 的 TEA可去極化膜電位至 －42.4±2.8mV、－41.2±1.8mV、－34.1±1.9mV、－22 ±3.1mV(P ＜0.05)。GST對(duì)膜電位的去極化作用也呈現(xiàn)出與TEA類(lèi)似的可逆性以及濃度依賴(lài)性。10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L的 GST可去極化膜電位至 －37.2±1.7mV、－29.85 ±1.65mV、－25.25 ±1.95mV(P ＜0.05)。 Daidzein (100μmol/L)、 tyrophostin25(10μmol/L)則對(duì)膜電位沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)。

3 討論

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，PTK能調(diào)節(jié)諸多離子通道活性，包括鈣通道［11］、鈉通道［12］、鉀通道［13］、還有容量激活氯通道［14］。GST作為最常用的PTK抑制劑，也必然能影響離子通道的活性。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GST能增強(qiáng)人心房肌細(xì)胞容量敏感氯電流［5］，抑制大鼠心室肌細(xì)胞電壓門(mén)控鉀通道［6］，兔心室肌細(xì)胞鈉電流［7］。然而GST對(duì)離子通道的作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，一些學(xué)者認(rèn)為GST對(duì)離子通道的作用與其抑制PTK無(wú)關(guān)，而是GST直接影響離子通道的結(jié)果，其理由在于GST無(wú)活性的類(lèi)似物Daidzein對(duì)離子通道也有與GST相似的作用。Weinreich等發(fā)現(xiàn)GST可以直接激活豚鼠心室肌細(xì)胞囊性纖維變性膜透性調(diào)節(jié)蛋白氯通道［8］。GST還可直接抑制兔冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鉀電流［9］，豚鼠心室肌細(xì)胞鉀電流［10］。我們研究發(fā)現(xiàn)，GST可以抑制大鼠MASMC的IK，而Daidzein對(duì)IK的抑制作用不顯著，另一種PTK抑制劑tyrphostin25也可以抑制IK。由此可見(jiàn)，GST對(duì)大鼠MASMC的IK抑制作用緣于其對(duì)PTK的抑制。

ATP是細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化的重要底物，蛋白激酶就是將ATP的γ磷酸基轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化的一類(lèi)磷酸轉(zhuǎn)移酶。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP缺失時(shí)，蛋白磷酸化就不能進(jìn)行。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)液不含ATP時(shí)，GST和tyrphostin25失去了對(duì)IK的抑制作用，這表明GST抑制IK的機(jī)制中還涉及蛋白磷酸化。

MASMC的4種鉀通道中，KV通道在PASMC去極化時(shí)開(kāi)放;KCa通道在MASMC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高及細(xì)胞去極化時(shí)開(kāi)放，對(duì)膜電位水平起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。生理情況下只有KV通道開(kāi)放以維持靜息膜電位，而KCa通道處于關(guān)閉狀態(tài)［15］。KV通道抑制劑可以使SMC顯著去極化，KCa通道抑制劑則對(duì)靜息膜電位沒(méi)有明顯影響［16］。TEA半數(shù)阻斷KCa通道的濃度為 0.2mmol/L［16］，半數(shù)阻斷 KV通道的濃度為3.1mmol/L［17］。因此低濃度的TEA對(duì)靜息膜電位影響較小，高濃度TEA則可顯著去極化膜電位，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是如此。我們發(fā)現(xiàn)，盡管GST和tyrphostin25都可以抑制IK，但只有GST可以濃度依賴(lài)性去極化膜電位。表明GST抑制了KV通道，GST對(duì)其他鉀通道是否也有抑制作用還不能確定，而tyrphostin25可能影響了KCa通道而對(duì)KV通道影響較小。GST和tyrphostin25作為酪氨酸激酶抑制劑，各自有著不同的作用底物。GST能抑制酪氨酸激酶pp60 V-SRC的活性，而對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶、PKA和PKC沒(méi)有抑制作用;tyrphostin25則是受體酪氨酸激酶的抑制劑。因此我們推測(cè)GST通過(guò)抑制pp60 V-SRC的活性間接致使KV通道磷酸化，從而抑制了IK并使MASMC膜電位去極化。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究了PTK抑制劑GST對(duì)大鼠MASMC的 IK的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GST和 tyrphostin25可以快速可逆的抑制IK，其作用與蛋白磷酸化相關(guān)。但僅GST可以濃度依賴(lài)性去極化膜電位，tyrphostin25對(duì)膜電位影響不顯著。GST抑制IK是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，除了抑制PTK活性外，還有哪些因子參與其中，最終使哪種鉀通道失活，都需要進(jìn)一步的研究探討。

［1］ Moudgil R，Michelakis ED，Archer SL.The role of k+channels in determining pulmonary vascular tone，oxygen sensing，cell proliferation，and apoptosis:implications in hypoxic pulmonary vasoconstriction and pulmonary arterial hypertension［J］.Microcirculation，2006，13(8):615－632.

［2］ Jackson WF.Potassium channels in the peripheral microcirculation［J］.Microcirculation，2005，12(1):113-127.

［3］ Wellman GC.Ion channels and calcium signaling in cerebral arteries following subarachnoid hemorrhage［J］.Neurol Res，2006，28(7):690－702.

［4］ Dixon RA，F(xiàn)erreira D.Genistein［J］.Phytochemistry，2002，60(3):205－211.

［5］ Du Xl，Gao Z，Lau CP，et al.Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on volume-sensitive chloride current in human atrial myocytes:evidence for dual regulation by Src and EGFR kinases［J］.J Gen Physiol，2004，123(4):427 － 439.

［6］ Gao Z，Lau CP，Wong TM，et al.Protein tyrosine kinase-dependent modulation of voltage-dependent potassium channels by genistein in rat cardiac ventricular myocytes［J］.Cell Signal，2004，16(3):333－341.

［7］ Wang Y，Wagner MB，Kumar R，et al.Inhibition of fast sodium current in rabbit ventricular myocytes by protein tyrosine kinase inhibitors［J］.Pflugers Arch，2003，446(4):485 －491.

［8］ Weinreich F，Wood PG，Riordan JR，et al.Direct action of genistein on CFTR［J］.Pflugers Arch，1997，434(4):484 －491.

［9］ Ko EA，Park WS，Son YK，et al.The effect of tyrosine kinase inhibitor genistein on voltage-dependent K+channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells［J］.Vascul Pharmacol，2009，50(1 － 2):51－56.

［10］ Chiang CE，Luk HN，Chen LL，et al.Genistein inhibits the inward rectifying potassium current in guinea pig ventricular myocytes［J］.J Biomed Sci，2002，9(4):321 － 326.

［11］ Dubuis E，Rockliffe N，Hussain M，et al.Evidence for multiple Src binding sites on the alpha1c L-type Ca2+channel and their roles in activity regulation.［J］.Cardiovasc Res，2006，69(2):391 －401.

［12］ Ahern CA，Zhang JF，Wookalis MJ，et al.Modulation of the cardiac sodium channel NaV1.5 by Fyn，a Src family tyrosine kinase［J］.Circ Res，2005，96(9):991 －998.

［13］ Missan S，Linsdell P，Mcdonald TF.Tyrosine kinase and phosphatase regulation of slow delayed-rectifier K+current in guinea-pig ventricular myocytes［J］.J Physiol，2006，573(Pt 2):469 － 482.

［14］ Walsh KB，Zhang J.Regulation of cardiac volume-sensitive chloride channel by focal adhesion kinase and Src kinase［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2005，289(6):2566 －2574.

［15］ Ko EA，Han J，Jung ID，et al.Physiological roles of K+channels in vascular smooth muscle cells［J］.J Smooth Muscle Res，2008，44(2):65－81.

［16］ Brayden JE，Nelson MT.Regulation of arterial tone by activation of calcium-dependent potassium channels［J］.Science，1992，256(5056):532－535.

［17］ Tammaro P，Smith AL，Hutchings SR，et al.Pharmacological evidence for a key role of voltage-gated K+channels in the function of rat aortic smooth muscle cells［J］.Br J Pharmacol，2004，143(2):303－317.