邱玉玉 李曉霞③ 武專昌 崔治中 孫淑紅 張顯忠

(山東農業(yè)大學動物科技學院動物醫(yī)學院,泰安271018)

一株A和B亞群禽白血病病毒特異性單克隆抗體的制備及其特性①

邱玉玉②李曉霞②③武專昌 崔治中 孫淑紅 張顯忠②

(山東農業(yè)大學動物科技學院動物醫(yī)學院,泰安271018)

目的:制備A和B亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)特異性單克隆抗體。方法:用ALV-A-SDAU09C1株的env-gp85基因的PCR產物構建重組表達性質粒pET32a-SDAU09C1-gp85,經IPTG誘導后,表達分子量為53 kD的ALV-A囊膜gp85蛋白與GST的融合蛋白,將表達產物免疫BALB/c小鼠,取其脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合,篩選雜交瘤細胞株。結果:獲得了1株(A6D1株)能與A和B亞群ALV發(fā)生反應但不與J亞群ALV反應的雜交瘤細胞株。Western blot試驗結果表明,單克隆抗體識別的A和B亞群ALV囊膜糖蛋白的分子量為53 kD。在IFA中,這株單克隆抗體可以與所試驗的3株ALV-A和1株ALV-B毒株反應,而與4株ALV-J亞群的毒株不反應。結論:A6D1株單克隆抗體可以用于A和B亞群ALV感染的診斷和流行病學調查,彌補了目前只有J亞群ALV特異性單克隆抗體可用的不足。

禽白血病病毒;AB亞群;囊膜蛋白;單克隆抗體

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.07.014①本文受國家公益性行業(yè)重大項目(#200803019)、山東省科技攻關項目(#2010GNC10924)和泰山醫(yī)學院學?？蒲杏媱濏椖?# 2010ZR070)等資助

禽白血病(Avian leukosis)是由禽白血病病毒(A-vian leukosis virus,ALV)和禽肉瘤病毒(Avian Sarcoma Virus,ASV)群中的病毒感染引起的多種腫瘤性疾病的統稱。根據病毒囊膜蛋白和與病毒的宿主特異性相關的gp85蛋白抗原性不同,禽白血病可分為A～J 10個亞群,其中只有A 、B、C、D、E和 J亞群能感染雞。致病性外源性病毒以A、B和J為主,也是流行最為廣泛的三個外源性病毒亞群;C、D也具致病性,但是在雞群中很少見,E亞群主要以前病毒的形式存在[1]。自從秦愛建(2001)成功研制了ALV-J特異性單克隆抗體,我國對J亞群ALV的流行狀況有了大量報道[2-7]。但是我國近十年來沒有在全國范圍內對ALV采取有效的凈化措施,因此我國雞群特別是我國地方品系中存在其它亞型ALV感染的可能性是很大的[5]。近年來從我國不同品系雞中分離到A和B亞群ALV禽白血病病毒表明我國雞群中ALV感染的復雜性[8,9]。但是這些A和B亞群ALV卻只有在對分離的病毒env基因克隆測序后才能鑒定,如果能像J亞群白血病特異性單克隆抗體那樣,有一種對A、B亞群ALV的單克隆抗體,就可能在細胞培養(yǎng)上分離病毒后用幾個小時即可完成鑒定。因此,本研究試圖通過研制抗A和B亞群ALV的特異性單克隆抗體以用于A和B亞群ALV分子生物學上更深入的研究,同時為臨床診斷提供高質量的檢測試劑。

1 材料與方法

1.1 病毒 ALV-A-SDAU09C1(GenBank:HM452339.1)、ALV-A-SDAU09C3(GenBank:HM452340.1)、ALV-ASDAU09E2(GenBank:HM452342)株病毒分離于中國山東某雞場,并已鑒定為ALV-A的成員;ALV-BSDAU09C2(GenBank:HM46005)株病毒分離于中國山東某雞場,并已鑒定為ALV-B的成員;NX0101(Gen-Bank:DQ115805)、HN0101、HN0901 、BJ0901(三株均為本研究室分離保存)代表ALV-J亞群。

1.2 抗原 用本研究室分離保存的ALV-A-SDAU09C1株(GenBank:HM452339.1)的env-gp85基因的PCR產物克隆進表達性載體pET32a中,構建成重組質粒pET32a-SDAU09C1-gp85。將 重 組 質 粒 pET32a-SDAU09C1-gp85轉化的 BL21大腸桿菌培養(yǎng)并用IPTG誘導后,其菌體的超聲波裂解物用SDS-PAGE電泳分離蛋白質,經純化后備用。

1.3 細胞和實驗動物 DF1細胞系和能抵抗E亞群ALV(C/E)的0系雞胚成纖維細胞(CEF),以及對所有ALV都易感的15B1系CEF由于病毒的傳代和擴增;SP2/0細胞由本室保存;8～10周齡的BALB/c小白鼠購自山東大學醫(yī)學院。

1.4 試劑 1640培養(yǎng)基和H、A、T購自Gibco;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司;胎牛血清(FBS)和PEG1450(Sigma Chemical,St Louis,Mo)購自Sigma公司。

1.5 免疫動物和陽性雜交瘤細胞株的建立 參照文獻[11],把純化的禽白血病囊膜gp85蛋白,免疫8～10周齡的BALB/c小白鼠,取其小鼠的脾臟細胞和SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,融合劑為40%的PEG1450。待融合細胞長至孔底1/2時,通過間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細胞株,再利用有限稀釋法連續(xù)克隆2～3次。

1.6 單克隆抗體的制備 將篩選得到的雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)后,以5×106/0.5 ml雜交瘤細胞腹腔注射BALB/c小鼠,13～15天后待小鼠腹圍增大后用注射器收集腹水,1 000 r/min離心10分鐘,上清即為腹水MAb粗制品。

1.7 單克隆抗體的純化 用蛋白G-sepharose 4B填料親和純化、濃縮MAb。方法參照文獻[11,12]進行。在用紫外分光光度計測定提純腹水的OD280值,按照公式計算蛋白濃度?？贵w濃度mg/ml= OD280×0.75。

1.8 單抗的Western blot分析 Western blot的操作過程按照文獻[11,12]報道的進行。

1.9 單抗的效價測定 將純化的單抗作1∶21～1∶210倍比稀釋,用已經建立的間接法ELISA法測定效價,以P/N＞2的最大稀釋度作為抗體效價。

1.10 間接免疫熒光(IFA)檢測單抗的特異性 間接免疫熒光試驗的基本方法參照文獻[13]報道的方法進行。

2 結果

2.1 雜交瘤融合和篩選效果 采用上述的免疫和融合方法,我們在兩次融合中融合率均為90%,在第1次融合所用10塊96孔細胞培養(yǎng)板,每孔出現多個雜交瘤細胞克隆,篩選出一株抗ALV-AB陽性的單克隆細胞株。第2次融合用20塊96孔細胞培養(yǎng)板,每孔幾乎為單個或2～3個雜交瘤細胞克隆,經免疫熒光和ELISA篩選后獲得多株分泌抗體陽性的雜交瘤細胞,經篩選,最后獲得1株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株,命名為A6D1。

2.2 腹水單抗的純化 腹水經過飽和硫酸銨沉淀,經過蛋白G親和純化后得到的單克隆抗體濃度為0.926 mg/ml。

2.3 單抗的Western blot分析 取 10 μ l純化的表達蛋白,用等量的2×上樣緩沖液處理后,進行SDSPAGE(圖1),然后轉到NC膜上,經封閉,單抗200倍稀釋液孵育后,加入酶標羊抗鼠IgG孵育后,加底物顯色,于NC膜上出現一條清晰的條帶,該帶與標準分子量比較,其大小約為53 kD,說明這株單抗與所表達的gp85蛋白發(fā)生特異性結合,見圖2。

2.4 單抗的效價測定 用ELISA方法對A6D1株單抗的效價測定結果為:28。

2.5 單抗的特異性檢測 用IFA對試驗所獲得的A6D1株單克隆抗體的特異性進行了鑒定,結果證明,單抗A6D1是特異性抗ALV-AB的單克隆抗體,它們均與試驗的所有ALV-A、ALV-B分離株發(fā)生反應(圖3,表1),而不與ALV-J亞群的成員發(fā)生反應,這說明單抗A6D1是特異性抗外源性ALV-AB的單抗。不同濃度的A6D1株單克隆抗體與不同ALV毒株感染DF1細胞的IFA反應結果見表1。

圖1 ALV-A gp85蛋白的SDS-PAGE結果Fig.1 Results of SDS-PAGE of gp85 protein of ALV-A

圖2 單抗的Western blotting分析Fig.2 Western blot analysis of monoclonal antibody

圖3 單克隆抗體與ALV-A、B、J感染DF1細胞的間接免疫熒光反應結果Fig.3 IFA results of Mabs reacted with ALV-A,B,J infected DF1

表1 不同濃度的A6D1株單克隆抗體與不同ALV毒株感染DF1細胞的IFA反應結果Tab.1 IFA results of different concentrations of A6D1monoclonal antibodies reacted with different ALV strains

3 討論

近年來,雞白血病/血管瘤的發(fā)生給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重經濟損失,經典外源性禽白血病病毒的感染傳播逐漸引起養(yǎng)殖場及相關機構的重視。秦愛建等于2001年成功研制了ALV-J特異性單克隆抗體,在我國ALV-J的分離鑒定中發(fā)揮了重要的作用[2-7]。近幾年通過流行病學調查研究表明血管瘤的發(fā)生不僅由J亞群禽白血病病毒引起,同時也有由A、B亞群禽白血病病毒感染引起,ALV-J和ALVAB的感染率在自然界中大體各占50%,但是在臨床上往往在進行禽白血病病毒檢測時,由于有了ALVJ的特異性單克隆抗體,所以當用ALV-J單克隆抗體檢測到有ALV-J或者沒有檢測到ALV-J時檢測就結束了,從而可能遺漏了ALV-AB的檢測。然而隨著ALV-A和ALV-B相繼在我國不同品系雞群中分離得到[8,9,14],提高了ALV感染的復雜性。為了有效地控制和消滅該病,本研究成功地用雜交瘤技術研制出抗A和B亞群ALV囊膜糖蛋白的特異單克隆抗體,進而可以迅速準確的診斷和檢測雞群中的ALV。本研究用Western blot試驗證明了單克隆抗體A6D1株對所試驗的不同ALV-A和ALV-B毒株均能識別一條分子量為53 kD的蛋白質條帶,這一結果與ALV-A和ALV-B的env基因表達產物所獲得的結果相吻合,也與ALV其它亞群的囊膜糖蛋白的分子量相近。特異性試驗結果表明,單抗A6D1株能與所有試驗的ALV-A和ALV-B的分離毒株呈陽性反應,而不與試驗的ALV-J亞群的成員反應,證明它們是特異性抗A和B亞群ALV的抗體。因為本研究所用到的病毒是在DF1細胞(對E亞群ALV有抵抗力)上進行擴增的,因此單抗A6D1株特異性研究時可以不用考慮E亞群病毒得干擾。

本研究繼ALV-J特異性單克隆抗體成功研制后又成功制備了抗A和B亞群ALV病毒囊膜糖蛋白單克隆抗體,對于禽白血病病毒的研究是一個非常重要的補充,為今后禽白血病ELISA抗原診斷試劑盒的研制奠定了基礎,更為禽白血病病毒在病原學、血清學、組織化學和基因表達等方面進行研究提供了有力工具。

1 崔治中.我國雞群中禽白血病流行現狀和對策[J].中國家禽, 2009;31(13):1-3.

2 秦愛建,崔治中,Lee L et al.抗J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特異性單克隆抗體的研制及其特性[J].畜牧獸醫(yī)學報,2001;32:556-562.

3 秦愛建,劉岳龍,周綺雯 et al.J亞群禽白血病病毒的免疫熒光檢測效果[J].中國預防獸醫(yī)學報,2001;23(03):213-216.

4 Qin A,Lee L F,Fadly A M.Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup J avian leukosis[J].Avian Dis,2001;45: 938-945.

5 Cui Z Z,Du Y,Zhang Z et al.Comparison of Chinese field strains of avian leukosis subgroup J viruses with prototype strain HPRS-103 and United States strains[J].Avian Dis,2003;47:1321-1330.

6 成子強,張 利,劉思當 et al.中國麻雞中發(fā)現禽J亞群白血病[J].微生物學報,2005;45:584-587.

7 Cui Z Z,Sun S H,Meng S S.Simultaneous endemic infections with subgroup J avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus in commercial and local breeds of chickens[J].Avian Pathol,2009;38:443-448.

8 朱美真,吳玉寶,崔治中.地方品系雞中一株 A亞群雞白血病病毒的分離和鑒定[J].中國動物傳染病學報,2009;174:31-35.

9 趙冬敏,張青嬋,崔治中.蘆花雞中B亞群禽白血病病毒的分離與鑒定[J].病毒學報,2010;26(1):74-78.

10 陳 晨,曹 紅,陳福勇.抗禽白血病p27抗原單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2007;24(4):287-289.

11 E哈洛,D萊恩.抗體技術試驗指南[M].北京:科學出版社, 2002:188-2051

12 汪家政,范 明.蛋白質技術手冊[M].北京:科學出版社,2001: 165-188.

13 秦愛建,崔治中,段玉友.抗馬立克氏病毒pp38血清與不同血清型病毒的免疫交叉反應[J].微生物學報,1994;34(5):393-397.

14 Zhang Q,Zhao D,Guo H et al.Isolation and identification of a subgroup A avian leukosis virus from imported meat-type grand-parent chickens [J].Virologica Sinica,2010;25(2):130-136.

[收稿2011-01-29 修回2011-02-14]

(編輯 許四平)

Development and characterization of monoclonal antibody to subgroup A and B avian leukosis virus

QIU Yu-Yu,LI Xiao-Xia,WU Zhuan-Chang,CUI Zhi-Zhong,SUN Shu-Hong,ZHANGXian-Zhong.College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China

Objective:Development and characterization of monoclonal antibody to subgroup A and B avian leukosis virus.MethodsThe env-gp85 gene of ALV-A-SDAU09C1 was subcloned into the prokaryotic expressing vector pET32a and recombinant vector pET32a-SDAU09C1-gp85 was further transformed into Escherichia coli strain BL21 for expression under the induction of IPTG.After IPTG induction, there was a new protein band about 53 kD on SDS-PAGE.The expressed proteins were vaccinated into Balb/c mice.ResultsOne Mab (A6D1),which reacted with all exogenous subgroups of AL-AB but not with endogenous subgroup J,was obtained.Using immunofluorescence assay(IFA),A6D1 reacted with 3 ALV-A and 1 ALV-B,but not with 4 ALV-J.Western Blot showed that molecular weight of ALV AB envelope glycoprotein or unglycosylated envelope protein recognized by Mabs was about 53 kD.ConclusionA6D1 can be used for diagnosis and epidemology of ALV-AB,which compensated for only the subgroup J ALV could be used in clinical.

Avian leukosis virus;Subgroup AB;Envelope protein;Monoclonal antibody

S855.1

A

1000-484X(2011)07-0639-04

②泰山醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,泰安271000

③同為第一作者

邱玉玉(1979年-),男,講師,在讀博士,主要從事動物分子病毒學和分子生物學研究;

及指導教師:崔治中(1944年-),男,教授,博士生導師,主要從事禽病學及動物病毒學研究,E-mail:zzcui@ sdau.edu.cn。