何 麗 魏茂提 王世鑫 胡役蘭 (武警甘肅總隊醫(yī)院內(nèi)科,蘭州730050)

HLA-A基因多態(tài)性與SARS易感性及癥狀關(guān)系的研究①

何 麗 魏茂提②③王世鑫④胡役蘭②(武警甘肅總隊醫(yī)院內(nèi)科,蘭州730050)

目的:研究中國北方漢族人群HLA-A基因多態(tài)性與SARS-Cov易感性及癥狀的關(guān)系。方法:采用病例-對照研究設(shè)計,應(yīng)用PCR-SBT的研究方法對53例SARS患者、44例高危人群和77例健康人員的HLA-A位點等位基因型分布進(jìn)行研究,運用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間比較采用 χ2檢驗,計算比值比(OR)及其 95%可信區(qū)間(95%CI)。結(jié)果:與高危人群比較,SARS病人HLA-A*2453(P=0.039,OR=4.479,95%CI 0.955～21.015)基因型出現(xiàn)頻率較高,兩者有統(tǒng)計學(xué)意義;與健康人群比較,SARS病人HLA-A*2444(P=0.029)基因型頻率顯著減低;SARS患者輕癥組和重癥組的HLA-A位點的等位基因頻率分布相比較未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論:我國華北地區(qū)漢族人群中HLA-A*2453可能與SARS的易感性相關(guān),而等位基因HLA-A*2444可能具有保護作用。HLA-A基因多態(tài)性與SARS患者病情嚴(yán)重程度可能無關(guān)。

SARS;HLA-A基因;基因多態(tài)性;易感性

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.07.012①本文受天津市科技攻關(guān)重點項目(05YFSZSF02900)和武警醫(yī)學(xué)院院級項目(WY-2006-16)資助

嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)是由新型冠狀病毒(SARS-Cov)感染引起的一種新發(fā)人類傳染病。SARS暴發(fā)后,香港的研究資料顯示HLA-B*0703和HLA-DRB1*0301可能與SARS疾病的進(jìn)展顯著相關(guān)[1]。日本學(xué)者針對越南SARS患者的研究認(rèn)為ACE1基因的插入/缺失(I/D)多態(tài)性與SARS患者的低氧狀態(tài)有關(guān),同時,認(rèn)為OAS-1基因第3外顯子A/G單核苷酸多態(tài)性可能與SARS的易感性有關(guān)[2,3]。臺灣學(xué)者報道HLA-B*4601和HLA-B*5401可能與SARS-Cov的易感性有關(guān),并且HLA-B*4601與SARS的病情輕重密切相關(guān),未發(fā)現(xiàn)HLA-A基因與SARS的易感性有關(guān)[4]。

由于基因多態(tài)性研究在不同種族和地區(qū)存在著明顯的差異,因此,各地的研究結(jié)果可能會有所不同。有資料顯示,我國不同民族或不同地區(qū)漢族人的HLA-A等位基因頻率分布有所不同[5]。據(jù)此,我們推測中國漢族人群SARS-Cov的感染可能存在與其他地區(qū)研究結(jié)果不同的易感等位基因。SARS的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)亞洲的SARS病例主要分布在中國大陸(北京、廣東、山西、內(nèi)蒙古、河北、天津等地區(qū))[6,7]。因此,有必要對我國大陸SARS患者的易感性與基因多態(tài)性進(jìn)行深入探討。我們采用PCR擴增產(chǎn)物直接測序法(PCR-SBT)對我國華北地區(qū)漢族SARS患者HLA-A位點進(jìn)行高分辨率基因分型。探討我國大陸漢族人群HLA-A基因多態(tài)性與SARSCov易感性的相關(guān)性,以期為闡明遺傳因素在SARS發(fā)病中的作用提供一些有益的線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2003年4～6月期間天津市某醫(yī)院臨床確診并治愈的SARS患者53例作為病例組。SARS的診斷符合WHO和我國公布的SARS患者臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),血清SARS冠狀病毒特異性抗體IgG檢測陽性[8]。選擇本醫(yī)院實施疫區(qū)封鎖后,參與SARS患者的救治和護理工作的醫(yī)護人員(Health care workers,HCW)44例作為高危人群,血清SARS冠狀病毒特異性抗體檢測均陰性。同時,隨機選取某學(xué)院入學(xué)的健康狀況良好的學(xué)員77例作為對照組。以上所有研究人員均為漢族,主要來自我國華北地區(qū),且無血緣關(guān)系。

SARS病人按住院期間病情嚴(yán)重程度分為輕癥SARS病人和重癥SARS病人。重癥SARS病人的判定按照《衛(wèi)生部SARS診療方案(2004版)》[9]執(zhí)行。具備以下三項中的任何一項,均可診斷為重癥SARS。(1)呼吸困難,成人休息狀態(tài)下呼吸頻率≥30次/min,且伴有下列情況之一:①X線胸片顯示多葉病變或病灶總面積在正位胸片上占雙肺總面積的1/3以上。②病情進(jìn)展快,48小時內(nèi)病灶面積增大超過50%且在正位胸片上占雙肺總面積的1/4以上;(2)出現(xiàn)低氧血癥,氧合指數(shù)低于300 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa);(3)出現(xiàn)休克或多器官功能障礙綜合征(MODS)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 抽取SARS病人、高危人群及健康對照者外周血3ml,用EDTA-Na2抗凝,提取有核細(xì)胞,然后用基因組DNA提取試劑盒(北京天為時代公司)提取基因組DNA。

1.2.2 HLA-A基因的擴增 根據(jù)文獻(xiàn)[10,11]由上海博亞生物有限公司合成HLA-A位點PCR擴增引物。上游引物序列:5′-GAAACSGCCTCTGYGGGGAGA AGCAA-3′,下游引物序列 :5′-TGTTGGTCCCAATTGTC TCCCCTC-3′。PCR反應(yīng)體系的組成:DNA 模板 2 μ l (約 10～100 ng),Taq酶 0.5 μ l(10 U/μ l),dNTP 5 μ l (1 mmol/L),10 ×BUFFER 5 μ l,上 、下游引物各 5 μ l (6 μ mol/L),加雙蒸水至 50 μ l。反應(yīng)條件 :94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸1分鐘,循環(huán)35次,72℃后延伸7分鐘。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化、測序和HLA-A基因型判定 用Gel Extraction Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)純化PCR產(chǎn)物。序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司采用ABI 377測序議完成。對DNA序列結(jié)果采用計算機C#語言設(shè)計并編寫高分辨HLA分型軟件(V1.0)進(jìn)行基因分型。

1.3 統(tǒng)計分析 用直接計數(shù)法計算各等位基因的表型頻率。采用統(tǒng)計處理軟件SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各組間等位基因頻率的比較用 χ2檢驗(根據(jù)例數(shù)或單元格理論頻數(shù)情況采用 χ2連續(xù)校正檢驗或Fisher確切檢驗),并以比值比(OR)表示相對風(fēng)險度,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A位點的等位基因與SARS-CoV易感性的相關(guān)性研究 與高危人群比較,SARS病人中, HLA-A*2453等位基因頻率顯著增高(P＜0.05);與健康對照人群比較,SARS病人中,HLA-A*2444等位基因頻率顯著減低(P＜0.05),見表1。出現(xiàn)頻率低的等位基因數(shù)據(jù)未列出。

2.2 HLA-A基因多態(tài)性與SARS病人病情程度相關(guān)性研究 53例SARS病人中分布頻率較高的三種等位基因 HLA-A*1119、2453、110101在輕癥SARS病人中陽性率分別為2.3%、11.4%、6.8%,在重癥SARS病人中陽性率分別為11.3%、8.1%、6.5%。比較輕癥組和重癥組HLA-A位點的等位基因頻率分布情況,均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),見表2。出現(xiàn)頻率低的等位基因數(shù)據(jù)未列。

3 討論

HLA系統(tǒng)是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在機體的免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。HLA與某些疾病的易感性密切相關(guān),是研究疾病易感性最不可忽視的遺傳因素[12]。HLA-A是HLA-Ⅰ類基因中最具多態(tài)性的位點,產(chǎn)生了為數(shù)眾多的等位基因,有關(guān)HLA-A位點核苷酸序列的檢測,尤其是第2、3外顯子高度變異區(qū)的檢測,在免疫學(xué)及疾病發(fā)病機制的研究中具有重要意義。HLA分子抗原結(jié)合凹槽中序列基序是由每個等位基因編碼的,眾多的HLA多態(tài)性導(dǎo)致了抗原結(jié)合凹槽的構(gòu)象及結(jié)合、遞呈抗原肽給T細(xì)胞的效率大大不同,使得不同的HLA基因型對疾病的易感性不同[13-15]。由于HLA的復(fù)雜性及其在免疫系統(tǒng)中的重要作用,許多累及免疫系統(tǒng)的病毒感染性疾病與HLA基因多態(tài)性有關(guān),進(jìn)行HLA基因多態(tài)性與病毒感染性疾病的相關(guān)性研究有助于從基因水平上揭示病毒感染性疾病發(fā)生和發(fā)展的機理。具有烈性傳染性的SARS是由新型SARS-Cov感染引起的、以累及呼吸和免疫系統(tǒng)為主要病理和臨床表現(xiàn)的傳染性疾病。有許多證據(jù)表明,SARS-Cov感染可導(dǎo)致病人淋巴細(xì)胞明顯減少和外周淋巴組織的病理損傷。多數(shù)SARS病人外周血白細(xì)胞計數(shù)正?；蚪档?而CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞明顯低于正常人,病情越重,T淋巴細(xì)胞計數(shù)下降越明顯。SARS病人恢復(fù)后,T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能逐漸恢復(fù)正常[16,17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HLA-B*5502基因型可能在SARS發(fā)生中起保護作用,而HLA-B*130201和 5801基因型可能是SARS的易感基因[18]。我們進(jìn)一步對HLA-A基因進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)等位基因HLA-A*2453在SARS病人中以較高頻率出現(xiàn),但在高危人群中出現(xiàn)頻率很低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.039);高危人群組與健康人群組比較,HLA-A*2453等位基因在高危人群中的出現(xiàn)頻率雖然也呈較低趨勢(χ2=3.130,P=0.077),但無統(tǒng)計學(xué)差異;以上結(jié)果可提示攜帶HLA-A* 2453的個體感染SARS的危險性可能較高,即HLAA*2453可能是SARS的易感基因。SARS病人和健康人群比較,HLA-A*2444等位基因出現(xiàn)頻率有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.029),53例SARS病人中沒有檢出這種等位基因,但HLA-A*2444在健康人群中的出現(xiàn)頻率卻高達(dá)5.84%,提示SARS病人可能由于缺乏該等位基因而對SARS冠狀病毒易感,即HLA-A* 2444可能是SARS的保護等位基因,但需要更多資料證實。

表1 SARS病人、高危醫(yī)護人員及正常對照人群HLA-A位點等位基因頻率Tab.1 Allele analysis of the HLA-A in SARS cases,HCW and controls

表2 HLA-A*1119、2453和 110101等位基因在輕癥 SARS病人和重癥SARS病人中的比較Tab.2 Allele frequencies of the HLA-A*1119,2453 and 110101 in mild cases and severe cases among SARS patients

本研究結(jié)果與同濟醫(yī)學(xué)院Xiong[19]的研究結(jié)果不一致,Xiong等人的研究結(jié)果顯示95名廣州SARS患者中檢測出HLA-A23[P=0.0361,OR,21.6(95% CI,0.39～36.90)]和HLA-A34[P=0.0361,OR,21.6 (95%CI,0.39～36.90)]以較高頻率出現(xiàn),而等位基因HLA-A33[P=0.02,OR,0.5(95%CI,0.39～1.37)]的現(xiàn)頻率較低,然而經(jīng)校正P值后均無統(tǒng)計學(xué)意義。本課題研究結(jié)果與Xiong等人的研究結(jié)果不一致,可能的原因有:(1)可能與人群HLA分布的地域差異有關(guān),HLA具有顯著的人種、民族和地域差異,其表現(xiàn)型在同種疾病不同人種和地區(qū)有顯著性差異;(2)由于所采用的實驗研究方法不同所致;本研究采用基于PCR測序的高分辨分型方法,與Xiong等采用的中、低分辨分型方法不同。這種不同可能影響實驗結(jié)果。(3)可能與不同地區(qū)SARS-Cov病毒本身的不同有關(guān)。由于本研究病例感染的病毒來源晚于Xiong研究提及的病例,因此病毒是否變異造成這種結(jié)果差異也需要進(jìn)一步研究探討。(4)由于本研究樣本含量較小,使研究結(jié)果的可靠性受到了限制,可能存在信息偏倚。因此,研究HLA-A基因多態(tài)性與SARS-CoV易感性的關(guān)系需要多家單位聯(lián)合,從而獲得更加肯定的結(jié)論[20]。

有文獻(xiàn)報道HLA-Ⅰ、Ⅱ基因可能與病毒感染性疾病的病情程度相關(guān)[21]。Carrington等[22]的研究結(jié)果顯示HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗原能夠影響HIV感染的病情進(jìn)展程度,原因可能是控制早期病毒載量的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的變異度受限。香港的Ng MH等[1]采用PCR-SSP法對87例SARS病人HLA-Ⅰ、Ⅱ類基因進(jìn)行DNA分型,并與香港骨髓庫登記結(jié)果進(jìn)行比較,認(rèn)為HLA-B*0703和HLA-DRB1*0301基因型與SARS疾病的進(jìn)展顯著相關(guān)。本研究中我們回顧了SARS病人臨床資料,將其病情按照標(biāo)準(zhǔn)[11]分為輕癥組和重癥組,以分析SARS病情嚴(yán)重程度與HLA-A基因的相關(guān)性。結(jié)果提示:SARS病人中出現(xiàn)頻率較高的三組等位基因HLA-A*1119、2453、110101在輕癥組與重癥組之間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。SARS病人之所以出現(xiàn)臨床癥狀輕重不一,分析其原因可能與病人年齡、SARS-Cov的毒力和病毒變異等多種因素作用有關(guān),也可能與本研究樣本數(shù)較小有關(guān)。因此HLA基因多態(tài)性是否與SARS病情程度有關(guān),還需要近一步擴大樣本量研究證實。

SARS作為一種新發(fā)傳染病,其發(fā)病可能是遺傳和環(huán)境等多種因素相互作用所致,在此過程中,每種因素對疾病的影響可能是微效的,且存在著交互影響(協(xié)同或拮抗)。因此,在SARS-CoV感染的易感因素研究中,有必要進(jìn)行遺傳、環(huán)境等多因素分析,并且要考慮到各種因素之間的相互作用;而SARS的病程進(jìn)展、輕重程度及預(yù)后也可能與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān),有待于更多的研究工作來證實。

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[收稿2010-09-09 修回2011-02-22]

(編輯 張曉舟)

Study on the roles of HLA-A gene polymorphism in the susceptibility and symptom of SARS-Coronavirus infection

HE Li,WEI Mao-Ti,WANG Shi-Xin,HU Yi-Lan.Gansu Provincial Corps Hospital,Chinese People's Armed Police Force,Lanzhou 730050,China

Objective:To study the association betweenHLA-A gene polymorphism and the susceptibility and symptom of SARS-Coronavirusinfection inNorthern Chinese Han ethnics.MethodsHLA-A were typed in 53SARS cases,44 high risks and77 controls using PCR-SBT methods in two case-control studies.Data were analyzed using SPSS version 11.5and chi squares andORwere usedto show the differences and association.ResultsThe frequency of HLA-A*2453 allele in SARS patients was markedly higher than that of the high risk care workers(P= 0.039,OR=4.479,95%CI 0.955-21.015).However,the frequency of HLA-A*2444 allele in SARS patients was lower than that of the health control(P=0.029).There was no significant difference of the distribution of HLA-A allele frequency in mild cases and severe cases. Conclusion:Genotype of HLA-A*2453may be one risk factor for infection of SARS-Cov,however,HLA-A*2444may be protect factor for it infection.The severity of SARS may not relate with the genotype of HLA-A.

SARS;HLA-A;Gene polymorphism;Susceptibility

R392.11

A

1000-484X(2011)07-0630-04

②武警醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室,天津300162

③通訊作者,E-mail:weimaoti@yahoo.com.cn

④天津市東麗醫(yī)院,天津300001

何 麗(1973年-),女,碩士,主治醫(yī)師,主要從事分子生物學(xué)研究。

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