焦鳳萍 劉 莉 于愛蓮 王 玉 于廣福 (泰山醫(yī)學(xué)院病原學(xué)教研室,泰安271000)

IL-18與HSV-2gD模擬抗原表位DNA疫苗的免疫效果觀察①

焦鳳萍 劉 莉②于愛蓮③王 玉 于廣福 (泰山醫(yī)學(xué)院病原學(xué)教研室,泰安271000)

目的:研究串聯(lián)重組核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6對機(jī)體的免疫效果。NP6為與HSV-2gD模擬抗原P6最相似的天然抗原表位序列(Accession Number:E00394)。方法:將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6肌內(nèi)注射免疫接種BALB/c小鼠3次,每次間隔1周。末次免疫后1周眼眶靜脈采血,ELISA法檢測小鼠血清特異性抗體滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后一月,處死小鼠,無菌分離脾臟,MTT法測定脾淋巴細(xì)胞增殖率。結(jié)果:重組核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6免疫小鼠后可刺激血清特異性抗體的產(chǎn)生,誘導(dǎo)分泌較高水平的IFN-γ和IL-18。可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。結(jié)論:重組核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6能誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫,從而為構(gòu)建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。

DNA疫苗;IL-18;單純皰疹病毒Ⅱ型;模擬抗原表位

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.07.017①本文為山東省衛(wèi)生廳資助課題(2007HZ037)和山東省自然科學(xué)基金(ZR2009CQ003)資助項(xiàng)目

單純皰疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus typeⅡ, HSV-Ⅱ)是生殖器皰疹(Genital herpes,GH)的主要病原體,并有明顯的親神經(jīng)性特征[1]。目前對HSV感染的治療方法有多種,但效果較差,并且對HSV的潛伏感染無治療作用[2]。因此研究有效的單純皰疹病毒疫苗是預(yù)防皰疹性疾病的最理想方法[3]。但傳統(tǒng)DNA疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平較低,所以如何增強(qiáng)和提高DNA疫苗的效果便成了新一代DNA疫苗設(shè)計(jì)和研究的關(guān)鍵問題。

本研究采用自行構(gòu)建的HSV-2重組DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,通過對各組小鼠血清中特異性IgG抗體、IL-18、IFN-γ的含量測定及脾淋巴細(xì)胞增殖率的檢測,研究其誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡雌性BALB/c小鼠,購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 質(zhì)粒 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.3 試劑 質(zhì)粒大量提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;MTT購自 Sigma公司;Hyclone RPMI-1640購自泰安聯(lián)星生物科技有限公司;小鼠干擾素γ(IFN-γ)ELISA 試劑盒、小鼠IL-18 ELISA 試劑盒,均購自上海西唐生物科技有限公司;弗氏完全佐劑購自Sigma公司。

1.4 重組質(zhì)粒的大量制備和純化 采用Omega E.Z. N.A.○REndo-free Plasmid Midi Kit無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒提取重組質(zhì)粒,并對之純化,按操作說明書進(jìn)行。

1.5 動(dòng)物分組及免疫方法 將小鼠隨機(jī)分為4組(每組10只):(1)空載體 pcDNA3.1(-)組;(2)pcDNA3.1-IL-18組;(3)pcDNA3.1-IL-18-HSV P6組;(4) pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6組。分別將重組質(zhì)粒100 μ g接種于小鼠雙下肢股四頭肌,連續(xù)免疫三次,每次間隔一周。首次免疫應(yīng)用弗式完全佐劑與注射質(zhì)粒1∶1混合,以加強(qiáng)免疫效果。末次免疫后一周眼眶靜脈采血,收集血清,-20℃冰箱保存。末次免疫后一月,處死小鼠,無菌分離脾臟,制備脾細(xì)胞。

1.6 ELISA法檢測免疫小鼠抗體水平 抗原(HSV-2gD模擬抗原表位P6合成多肽)包被后,37℃水浴2小時(shí),然后4℃包被過夜。PBS洗5次。每孔加10%小牛血清100 μ l,37℃水浴 30分鐘。PBS洗5次,加1∶100稀釋的待測血清,37℃水浴30分鐘。PBS洗5次,加100 μ l HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(二抗),37℃水浴30分鐘。PBS洗5次,加顯色液100μ l,37℃水浴15分鐘。終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm測OD值。

1.7 ELISA法檢測免疫小鼠血清IFN-γ及IL-18含量 用抗小鼠IFN-γ(或IL-18)單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IFN-γ(或IL-18)與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗小鼠IFN-γ(或IL-18),形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合,加入底物工作液顯藍(lán)色,最后加終止液。450 nm測OD值,IFN-γ(或IL-18)濃度與OD值成正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IFN-γ (或IL-18)濃度。

1.8 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率檢測 將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中,每孔加100 μ l,每個(gè)樣品三復(fù)孔,每孔加含gD模擬抗原表位P6合成多肽(10 g/ml)的培養(yǎng)液 100 μ l,混勻后置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。加入MTT 10 μ l, 37℃培養(yǎng) 4 小時(shí),吸棄上清,加入 DMSO 100 μ l,充分震蕩溶解10分鐘后,酶標(biāo)儀492 nm測定OD值。以刺激指數(shù)(SI)判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度:SI=實(shí)驗(yàn)組OD492-空白孔OD492值/陰性對照組OD492值-空白孔OD492。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清特異性IgG含量檢測 見圖1。免疫后各實(shí)驗(yàn)組的抗體水平有不同程度的提高,通過t檢驗(yàn)分析pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6組較其他組有明顯提高,P＜0.05; pcDNA3.1-IL-18-HSV P6組明顯高于pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6組,P＜0.05。表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒有較好的免疫效果,模擬抗原表位P6較NP6能產(chǎn)生更高滴度的抗體。

2.2 免疫小鼠血清IL-18含量檢測 見圖2。pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和 pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6三組的IL-18水平高于空載體pcDNA3.1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但三組之間比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),表明pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和 pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6由于整合有IL-18,其作為分子佐劑可在小鼠體內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生更高滴度的IL-18。

2.3 免疫小鼠血清IFN-γ含量檢測 見圖3。pcDNA3.1-IL-18組、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6組和 pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6組IFN-γ含量較空載體組均升高,P＜0.05。但三組之間兩兩比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＞0.05。表明 pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6由于整合有IL-18,其作為分子佐劑可在小鼠體內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生更高滴度的IFN-γ。

圖1 免疫小鼠血清特異性IgG含量的檢測Fig.1 The detection of specific IgG antibody of immune mice

圖2 免疫小鼠血清IL-18含量檢測Fig.2 The detection of serum IL-18 of immune mice

圖3 免疫小鼠血清IFN-γ含量檢測Fig.3 The detection of serum IFN-γof immune mice

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率檢測Fig.4 The detection of the level of splenocytes proliferation of immune mice

2.4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率檢測 見圖4。pcDNA3.1-IL-18-HSV P6組脾淋巴細(xì)胞增殖率高于其他各組,P＜0.05。其他各組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),表明pcDNA3.1-IL-18-HSV P6對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用。

3 討論

DNA疫苗具有操作簡單、易于純化、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),但誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的效率相對較低,尤其是對于大的動(dòng)物種系和人類,因此限制了它們的使用[4]。所以有效的DNA疫苗應(yīng)具備兩方面:一是疫苗的設(shè)計(jì)合理,二是采用恰當(dāng)?shù)拿庖叻椒ā?/p>

有資料表明,以細(xì)胞因子作為佐劑是增強(qiáng)免疫效果的一種行之有效的方法。在疫苗的設(shè)計(jì)過程中,我們以IL-18為佐劑,將HSV-2gD模擬抗原表位P6和NP6與IL-18分別融合構(gòu)建于真核表達(dá)載體中,并用質(zhì)粒形式接種。研究顯示pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6能顯著增強(qiáng)小鼠體內(nèi)的抗體水平、IL-18及IFN-γ水平。

不同的免疫接種途徑對DNA疫苗所誘導(dǎo)的免疫效果也不同,其中以肌肉注射免疫效果最強(qiáng)[5]。同時(shí)肌肉組織具有安全、體積大、免疫接種容量大等優(yōu)點(diǎn),因此多被用來進(jìn)行DNA疫苗的免疫注射[6]。為了提高DNA疫苗的免疫效果,我們采用小鼠股四頭肌注射重組質(zhì)粒的方法進(jìn)行免疫,并在首次免疫時(shí)應(yīng)用了弗氏佐劑以提高肌注質(zhì)粒表達(dá)水平。

此外,疫苗免疫劑量及間隔時(shí)間對DNA疫苗的免疫效果也有一定的影響。一般認(rèn)為,免疫應(yīng)答在一定的范圍內(nèi)存在劑量依賴性和飽和性,韓雙艷等研究發(fā)現(xiàn)HSV-2gDDNA疫苗免疫過程中,免疫劑量為100 μ g時(shí)血清內(nèi)中和抗體指數(shù)已經(jīng)較高,200 μ g時(shí)雖較100 μ g中和指數(shù)高,但沒有顯著性的差異,而且連續(xù)免疫后抗體滴度以幾何級(jí)數(shù)增長,較隔周免疫能夠較快的達(dá)到對數(shù)增長期。因此在實(shí)驗(yàn)中我們采用的免疫劑量為100 μ g,連續(xù)免疫三次,每次間隔一周,以加強(qiáng)免疫效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pcDNA3.1-IL-18-HSV P6組抗體水平高于pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6,可能有兩個(gè)方面的原因:①由于抗體檢測中抗原包被采用的是P6合成多肽,故pcDNA3.1-IL-18-HSV P6組較pcDNA3. 1-IL-18-HSV NP6組在抗原的空間構(gòu)象上更接近,所以結(jié)合率較高,測出的抗體滴度較高;②由于P6序列是采用噬菌體展示技術(shù)篩選出的模擬抗原表位,從而較NP6序列具有較高的抗原性,故而產(chǎn)生的特異性抗體滴度較高。我們發(fā)現(xiàn)只有pcDNA3.1-IL-18-HSV P6對小鼠淋巴細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用,這也證實(shí)了我們前期篩選的HSV-2gD模擬抗原表位序列P6具有較高的免疫原性。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的串聯(lián)重組DNA疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6既能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),產(chǎn)生高滴度的特異性抗體和IL-18及IFN-γ,也能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng),提高脾淋巴細(xì)胞增殖率,從而為構(gòu)建更加有效的HSV-2 DNA疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 肖 莎,江慶萍.應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)檢測原發(fā)性癲癇腦組織中病毒感染[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004;14(17):69-73.

2 RamaohandranS,Kinchington P R.Potential prophylactic andtherapeutic vaccines forHSV infections[J].Curr Pharm Des,2007;13(19):1965-1973.

3 焦鳳萍,于愛蓮,王 玉 et al.單純皰疹病毒2型gD模擬抗原表位的篩選及分析[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007;28(21):1937-1939.

4 陳紅梅,白雪帆,黃長形 et al.重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-IL-12/Fc對HBV preS2SDNA疫苗免疫作用的影響[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006;26(10):911-914.

5 袁正宏,方 昕,鄭玲潔 et al.免疫途徑及載體對乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影響的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 1999;19(1):25-28.

6 孫樹漢主編.核酸疫苗[M].上海:上海第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2000:158-160.

[收稿2011-02-16]

(編輯 張曉舟)

The immune responses of the DNA vaccine of IL-18 and HSV-2gD

JIAO Feng-Ping,LIU Li,YU Ai-Lian,WANGYu,YU Guang-Fu.The Department of Etiology of Taishan Medical University,Taian 271000,China

Objective:To study the immune responses of pcDNA3.1-IL-18-HSV P6 and pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6 genetic vaccine. NP6 is the similar sequence of natural HSV-2 gD from gene bank.MethodsThe recombinant plasmid pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6 and pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6 were used to inoculate BALB/c mice by intramuscular injection for three times,once a week.One week after the last vaccination,the levels of specific IgG antibody,IFN-γand IL-18 were detectedby ELISA;One month after the last vaccination,spleen cells of vaccinated mice were separated and proliferation of spleen lymphocytes was detected by MTT.ResultsAfter inoculated by pcDNA3.1-IL-18-HSV P6vaccine,the mice could produce higher level of splenocytes proliferation and secrect IFN-γ and IL-18 and specific antibody.Conclusionthe recombinant clone pcDNA3.1-IL18-P6 can effectively induce humoral and cellular immune responses,which offered the basic requirements for constructing new type of DNA vaccine.

DNA vaccine;Interleukin-18;HSV-Ⅱ;Mimotope

R392

A

1000-484X(2011)07-0654-03

②聊城市疾病預(yù)防控制中心,聊城252000

③通訊作者,E-mail:alyu@tsmc.edu.cn

焦鳳萍(1978年-),女,碩士,講師,主要從事病原體感染與優(yōu)生方面的研究,E-mail:fpjiao@tsmc.edu.cn。

·會(huì)訊·