馬騰，劉嘯白，薛一雪

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室；2.第96期臨床醫(yī)學(xué)7年制，沈陽(yáng) 110001）

C3胞外酶抑制緩激肽誘導(dǎo)的血腫瘤屏障通透性的增加

馬騰1，劉嘯白2，薛一雪1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室；2.第96期臨床醫(yī)學(xué)7年制，沈陽(yáng) 110001）

目的研究Ras基因家族成員A（RhoA）的特異性抑制劑C3胞外酶（exoenzyme）對(duì)緩激肽誘導(dǎo)的血腫瘤屏障通透性的作用。方法 應(yīng)用C3exoenzyme預(yù)處理大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后，測(cè)量跨內(nèi)皮阻抗值（TEER）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）流量，分析血腫瘤屏障的通透性的改變；應(yīng)用Western blot檢測(cè)緊密連接相關(guān)蛋白（ZO-1）的表達(dá)；應(yīng)用免疫熒光法觀察原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）結(jié)構(gòu)和分布的改變。結(jié)果 C3exoenzyme顯著抑制緩激肽誘導(dǎo)TEER值的降低、HRP流量的升高及ZO-1的表達(dá)，抑制ZO-1由內(nèi)皮細(xì)胞的邊緣向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，抑制絲狀肌動(dòng)蛋白由細(xì)胞膜邊緣向細(xì)胞中央?yún)^(qū)分布，分布于細(xì)胞邊緣的F-actin明顯增加，應(yīng)力纖維形成明顯減少。結(jié)論RhoA能夠介導(dǎo)緩激肽開放血腫瘤屏障。

RhoA；緩激肽；血腫瘤屏障；緊密連接；ZO-1；肌動(dòng)蛋白重排

治療藥物進(jìn)入腦組織發(fā)揮作用必須通過(guò)由緊密連接（tight junction，TJ）為主要構(gòu)成成分的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）［1］。雖然腫瘤血管與正常血管相比有不同的結(jié)構(gòu)和功能特征，但同樣存在血腫瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB），能阻止大部分抗癌藥物通過(guò)BTB進(jìn)入腫瘤組織［2］。研究顯示，如果腫瘤組織的藥物濃度提高2倍，其治療效應(yīng)則增加10倍［3］。因此增強(qiáng)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高到達(dá)治療部位的藥物濃度是提高治療效果的關(guān)鍵因素。我們的前期工作證明了緩激肽（bradykinine，BK）可以選擇性開放BTB［4］，但其具體機(jī)制仍不十分清楚。

研究顯示，在凝血酶介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損壞的過(guò)程中，伴隨著環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）表達(dá)的快速下降和Ras基因家族成員A（Rashomolog gene family member A，RhoA）激活［5］。同樣，我們的前期工作證實(shí)了cAMP和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）催化亞單位（PKAcs）在BK開放BTB過(guò)程中呈低表達(dá)［6］，提示低表達(dá)PKA有助于RhoA的激活［7］。有學(xué)者認(rèn)為，RhoA高表達(dá)使內(nèi)皮細(xì)胞中絲狀肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）聚集成束，變成應(yīng)力纖維，且其分布由原來(lái)的細(xì)胞膜邊緣區(qū)域變成細(xì)胞質(zhì)的中央?yún)^(qū)域，并使血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（VE-cadherin）和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin重分布，造成內(nèi)皮間的通透性升高［8］。因此我們推測(cè)RhoA可能參與BK開放BTB調(diào)節(jié)過(guò)程，擬通過(guò)本研究探討RhoA的特異性抑制劑C3胞外酶（exoenzyme）對(duì)緩激肽誘導(dǎo)的血腫瘤屏障通透性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

NU血清（BD Biosciences公司）；FBS（杭州四季青公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco公司）；zonula occludens-1（ZO-1）抗體（Zymed公司）；抗 β-actin抗體（Santa Cruz公司）；羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（北京中山生物技術(shù)公司）；phalloidin-TRITC熒光抗體，RhoA特異性抑制劑肉毒梭菌C3胞外酶，緩激肽，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和體外BTB模型的制作：用CO2吸入法處死＜1周的胎大鼠，開顱取全腦，去除腦膜。提取大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat brain microvascular endothelial cells，RBMECs） 及建立體外BTB模型的方法參照文獻(xiàn)［6］。首先，大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，將106個(gè)細(xì)胞種植在膠原包被的Transwell小室的下層，并加入適宜的培養(yǎng)基。2h后翻轉(zhuǎn)小室，加入新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)，將RBMECs接種至Transwell小室的上室（大約105個(gè)細(xì)胞）。細(xì)胞在共培養(yǎng)7～10d后融合。從此，每2d更換1次培養(yǎng)基。在共培養(yǎng)7～10d后，加入藥物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 BK及抑制劑的作用和分組：我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，BK（1μmol/L）處理 RBMECs 15min 時(shí)，BTB的通透性達(dá)到峰值，以后逐漸恢復(fù)。緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1是RhoA的下游分子，因此我們將RBMECs隨機(jī)分為7組（每組8例，每組BK終濃度為1μmol/L）：BK 0min 組、5min 組、10min 組、15min組、30min組和15min+C3exoenzyme組、對(duì)照組（無(wú)C6細(xì)胞共培養(yǎng)的RBMECs單層，加入等量的1μmol/L無(wú)菌生理鹽水作用15min）。取C3exoenzyme（50μg/ml）加入 BK 15min 組 Transwell小室的上室培養(yǎng)基中，作用4h后移去上室的所有培養(yǎng)基，加 BK（1μmol/L）至上室。

1.2.3 HRP流量測(cè)定：將Transwell中與C6細(xì)胞共培養(yǎng)的和單獨(dú)培養(yǎng)的RBMECs分別轉(zhuǎn)移至1個(gè)新的24孔板中。將含有0.5μmol/L HRP的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的上室中。在經(jīng)過(guò)BK作用后的特定時(shí)間點(diǎn)上，收集下室的培養(yǎng)基，通過(guò)色度法測(cè)量樣品中HRP的含量。HRP流量用通過(guò)每平方厘米表面積的皮摩爾數(shù)（pmol/cm2）表示。

1.2.4 Western blot檢測(cè)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布：當(dāng)Transwell小室的上室的細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，用含有0.1mmol/L EDTA（不含鈣、鎂離子）的PBS沖洗，細(xì)胞鏟小心刮取細(xì)胞，倒入1ml裂解液A （2mmol/L EDTA，10mmol/L EGTA，0.4%NaF，20mmol/L Tris-HCl，protease inhibitor cocktail，PMSF，1%Triton X-100，pH 7.5），4℃勻漿，離心，上清液為蛋白樣品液。加入抗ZO-1抗體（1︰500），抗β-actin抗體（1︰800），4℃孵育過(guò)夜，在羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗中室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光，X線片曝光、顯像，所得膠片用Chemi Imager 5500V2.0軟件掃描，通過(guò)Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)得光密度值（integrated density value，IDV）。

1.2.5 免疫熒光法觀察緊密連接相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)和分布：將生長(zhǎng)在蓋玻片上RBMECs單層用4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100透化，5%BSA封閉。間接免疫熒光技術(shù)步驟進(jìn)行操作，ZO-1抗體稀釋濃度1︰150，陰性對(duì)照用0.01mol/L PBS代替一抗，應(yīng)用FITC標(biāo)記的熒光二抗 （1︰150），避光條件下染色，甘油封片，熒光顯微鏡觀察，采集圖像。直接免疫熒光技術(shù)步驟進(jìn)行操作，phalloidin-TRITC熒光抗體（1︰200）孵育2h，熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C3exoenzyme抑制BK介導(dǎo)BTB通透性的增加

HRP流量測(cè)定結(jié)果顯示，BK以時(shí)間依賴性方式顯著增加HRP流量，BK 15min組HRP流量顯著高于對(duì)照組和BK 0min組（P<0.05），但BK 15min+C3exoenzyme組HRP流量較BK 15min組顯著降低（P<0.05）。見圖 1。

2.2 C3exoenzyme抑制BK介導(dǎo)RBMECs的緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1表達(dá)減少

Western blot結(jié)果顯示，BK作用5min開始，ZO-1表達(dá)逐漸降低。BK 15min組ZO-1表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和BK 0min組（P<0.05），但BK 15min+C3exoenzyme組ZO-1表達(dá)量較BK 15min組ZO-1表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。見圖2。

2.3 C3exoenzyme抑制BK介導(dǎo)的RBMECs緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1的重分布及細(xì)胞骨架F-actin的重排

免疫熒光分析顯示，在未處理的細(xì)胞中，ZO-1位于內(nèi)皮細(xì)胞邊緣，呈連續(xù)分布，ZO-1在細(xì)胞核中有表達(dá)（圖3A）。BK處理后，ZO-1的分布由連續(xù)狀態(tài)變?yōu)椴贿B續(xù)，由內(nèi)皮細(xì)胞的邊緣向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移（圖3B）。C3exoenzyme預(yù)處理后，ZO-1部分恢復(fù)連續(xù)分布狀態(tài)，ZO-1由內(nèi)皮細(xì)胞邊緣向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移明顯減少（圖3C）。BK作用前，F(xiàn)-actin呈環(huán)狀連續(xù)分布于RBMECs的邊緣，未見應(yīng)力纖維（圖3D）。BK作用后，分布于細(xì)胞邊緣的F-actin減少，應(yīng)力纖維形成增加，且分布在細(xì)胞中央?yún)^(qū)（圖3E）。C3exoenzyme預(yù)處理后，分布于細(xì)胞邊緣的F-actin明顯增加，應(yīng)力纖維形成明顯減少（圖3F）。

3 討論

本研究中，HRP流量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BK作用后HRP流量顯著增加，與Easton等［9］的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RhoA特異性抑制劑C3exoenzyme預(yù)處理后，BTB的通透性顯著升高，證明RhoA信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)BK介導(dǎo)的BTB通透性增加的過(guò)程。

胞質(zhì)附著蛋白Zonula occludens家族中的ZO-1同樣是構(gòu)成TJ的一個(gè)主要蛋白［10］。作為連接跨膜蛋白o(hù)ccludin和claudin-5與細(xì)胞骨架蛋白F-actin的橋梁蛋白，ZO-1的分布和表達(dá)的變化同樣影響TJ的結(jié)構(gòu)和功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，BK作用后，ZO-1表達(dá)顯著下降，C3exoenzyme預(yù)處理后，ZO-1表達(dá)量則顯著升高，說(shuō)明RhoA信號(hào)通路參與BK介導(dǎo)的TJ開放。

最近的研究顯示，F(xiàn)-actin在緊密連接復(fù)合物的結(jié)構(gòu)支撐和功能調(diào)節(jié)方面都發(fā)揮著重要的作用［12］。為了進(jìn)一步明確RhoA信號(hào)通路，與細(xì)胞骨架重排、緊密連接相關(guān)蛋白重分布、BTB通透性增高的關(guān)系，我們采用C3exoenzyme預(yù)處理后，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布的變化，明確RhoA信號(hào)通路與細(xì)胞骨架重排、緊密連接相關(guān)蛋白重分布的關(guān)系。細(xì)胞骨架有絲狀肌動(dòng)蛋白、中間纖維和微管3種組成成分，其中F-actin與內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的關(guān)系最為密切，在某些生理和病理?xiàng)l件下，F(xiàn)-actin聚集成束，變成應(yīng)力纖維，使細(xì)胞收縮。Birukova等［13］研究證實(shí)，RhoA具有激發(fā)應(yīng)力纖維形成，引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BK作用后，ZO-1重新分布，由細(xì)胞膜及細(xì)胞邊緣向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，同時(shí)F-actin由環(huán)狀連續(xù)分布于RBMECs的邊緣向細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生分布轉(zhuǎn)移，同時(shí)伴有大量應(yīng)力纖維形成。應(yīng)力纖維收縮，牽拉ZO-1蛋白，使細(xì)胞膜上跨膜蛋白重分布，緊密連接結(jié)構(gòu)變化，使BTB通透性升高。C3exoenzyme抑制了ZO-1的重分布、F-actin的重排和應(yīng)力纖維的形成。說(shuō)明RhoA信號(hào)通路參與了BK介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布，BTB通透性增高的過(guò)程。

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（編輯王又冬，英文編輯王又冬）

C3Exoenzyme Inhibits Bradykinin-induced Selective Increase of the Permeability of Blood-tumor Barrier

MA Teng1，LIU Xiao-bai2，XUE Yi-xue1
（1.Department of Neurobiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.The 96th Class，7-year Program，Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of C3exoenzyme，a specificRashomolog gene family member A （RhoA）inhibitor，on bradykinin（BK）-induced increase in blood-tumor barrier （BTB）permeability.MethodsRat brain microvascular endothelail cells（RBMECs）were pretreated with C3exoenzyme and then treated with BK for 15minutes.Horseradish peroxidase （HRP）flux and TEER assays were employed to reveal BTB permeability.The protein expression level of ZO-1was observed by Western blot.The stress fiber formation and distribution of filamentous actin （F-actin）and ZO-1were assessed by immunofluorescence microscopy.ResultsC3exoenzyme could partially inhibit endothelial leakage and restored normal TEER values in RBMECs.The expression level of ZO-1protein decreased significantly and it was prevented by C3exoenzyme.C3exoenzyme inhibited BK-induced relocation of ZO-1from cellular borders into the cytoplasm as well as stress fiber formation in RBMECs.ConclusionRhoA plays a key role in BK-induced openning of blood-tumor barrier.

RhoA；bradykinin；blood-tumor barrier；tight junction；ZO-1；actin rearrangement

R338.2

A

0258-4646（2011）02-0097-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0957.029

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872656，30670723，30973079）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20092104110015）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（1072033-1-00，1081266-9-00）

馬騰（1976-），男，講師，博士.

薛一雪，E-mail：xueyxiue888@yahoo.com.cn

2010-11-11