趙芳坤，趙江月，李嶔，于佳明，劉秋芳，趙恂，張勁松

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110005； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110032；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心二部，沈陽(yáng) 110001）

紫外線誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷與小窩蛋白1mRNA表達(dá)量下降有關(guān)

趙芳坤1，趙江月1，李嶔2，于佳明1，劉秋芳3，趙恂4，張勁松1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110005； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110032；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心二部，沈陽(yáng) 110001）

目的紫外線（UV）照射導(dǎo)致的氧化損傷是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的原因之一，而小窩蛋白（Caveolin）參與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)擬研究紫外線造成的氧化損傷中Caveolin-1表達(dá)變化與晶體上皮細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，同時(shí)探討阿司匹林（ASA）作為抗氧化劑對(duì)Caveolin-1表達(dá)及晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法 UVB（4.43mw/cm2）照射人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04（0s，5s，10s，20s），按照是否加入阿司匹林分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞活性；利用AnnexinV-EGFP法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；real time RT-PCR方法定量分析Caveolin-1mRNA的量隨照射劑量不同，及加入抗氧化劑前后所產(chǎn)生的變化。結(jié)果 隨UV照射時(shí)間延長(zhǎng)，單純紫外線照射組細(xì)胞活性，Caveolin-1mRNA表達(dá)量下降，細(xì)胞凋亡率增加。加入阿司匹林后，細(xì)胞活性增加。5s，10s組Caveolin-1mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組升高，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組下降（P<0.05）。但是照射20s的條件下，加藥后的細(xì)胞凋亡率及Caveolin-1mRNA的表達(dá)量較未加藥組無變化（P>0.05）。結(jié)論UV照射可造成人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，Caveolin-1mRNA表達(dá)量減少，推測(cè)Caveolin-1表達(dá)量的變化可能與凋亡有關(guān)。低劑量的阿司匹林（3μmol/L）可以在一定程度上減少UV照射造成的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，增加Caveolin-1的表達(dá)；但大劑量阿司匹林（>30μmol/L）會(huì)起到相反的作用，因此找到一個(gè)合適安全的劑量范圍具有一定臨床意義。

紫外線；小窩蛋白1；凋亡；阿司匹林；晶狀體上皮細(xì)胞

白內(nèi)障（cataract）是目前世界首位的致盲眼病。長(zhǎng)期慢性的紫外線（UV）輻射最先損害的靶組織是晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells，LECs）。研究發(fā)現(xiàn)人和動(dòng)物眼部多種類型的細(xì)胞膜上存在特殊的微區(qū)-小窩（caveolae）。小窩蛋白（Caveolin）是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在修復(fù)角膜上皮調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞及皮質(zhì)纖維細(xì)胞質(zhì)膜上的膽固醇分布，細(xì)胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)［1］，細(xì)胞間通訊［2］，特別是在晶狀體上皮細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時(shí)，保護(hù)細(xì)胞免遭氧化損傷等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Li等［3］研究認(rèn)為，晶體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，而氧化損傷則是晶體上皮細(xì)胞凋亡的重要誘發(fā)因素。阿司匹林作為一種常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化損傷和抑制蛋白質(zhì)水解的作用。

本研究通過UV照射人LECs造成氧化損傷模型，探討不同劑量UV照射造成的晶體上皮細(xì)胞凋亡及小窩蛋白1mRNA表達(dá)量之間的關(guān)系，以及阿司匹林的抗氧化損傷作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來源：人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科提供）。

1.1.2 主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（Hyclone公司），雙抗（青霉素、鏈霉素）Trizol（Invitrogen），Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time（Takara SYBR Green Assay），Real time PCR 試劑盒（Takara SYBR Premix Ex Taq），Annexin V-EGFP 凋亡檢測(cè)試劑盒（KeyGen Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit，MTT（碧云天細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒），阿司匹林、DMSO（美國(guó)Sigma公司）。紫外燈（美國(guó)spectronics corporation），酶標(biāo)儀（北京普朗公司），紫外分光光度計(jì)（日本SHIMADZU），Real time PCR儀（ABI 7500system），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur）

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5%的CO2孵箱，37℃培養(yǎng)。用紫外線照射細(xì)胞，并按是否加入抗氧化劑分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.2.2 抗氧化劑阿司匹林的配制：用DMSO配制阿司匹林儲(chǔ)存液（0.3mol/L），用無血清培養(yǎng)基梯度稀釋為（30，3mmol/L，300，30，3μmol/L）。

1.2.3 紫外線照射方法：紫外燈光譜范圍為250～365nm，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于紫外光源下10cm 處，強(qiáng)度為 4.43mw/cm2，照射時(shí)間為 0、5、10、20s，相應(yīng)的照射劑量約為 0、20、40、80mJ/cm2。照射前將培養(yǎng)液吸凈，用PBS沖洗1次，照射時(shí)打開培養(yǎng)皿蓋。對(duì)照組照射后換無血清培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組照射前用阿司匹林孵育2h，照射后換含有阿司匹林的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性：將細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h至單層細(xì)胞鋪滿孔底。按上述方法制造氧化損傷模型后，對(duì)照組換無血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組換阿司匹林稀釋液，培養(yǎng)24h。每孔加入20μl（5mg/ml）的MTT溶液，孵育4h后棄上清。每孔再加入150μl二甲基亞砜，溫和振蕩，用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，波長(zhǎng)為490nm，對(duì)吸光度值進(jìn)行比較分析。

1.2.5 Annexin V-EGFP凋亡檢測(cè)：收集對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞至離心管，每管細(xì)胞數(shù)≥1×105。加入500μl Binding Buffer，5μl Annexin V-EGFP，5μl PI 混勻。室溫避光反應(yīng)5～15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 Real time RT-PCR檢測(cè)小窩蛋白1mRNA表達(dá)：提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Real time PCR檢測(cè)小窩蛋白1mRNA的表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)如下：小窩蛋白 1正義鏈 5′-AACGATGACGTGGTCAAGATTG-3′； 反 義 鏈 5′-GCAGACAGCAAGCGGTAAAAC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)140bp）。β-actin正義鏈5′-CATCACCATTGGCAATGAGC-3′， 反 義 鏈 5′-TCGTCATACTCCTGCTTGC-3′（擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 351bp）。采用SYBR Green作為報(bào)告染料，96孔板檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，Ct值為3次重復(fù)所得的平均值。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃30s；95℃5s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用One-Way-ANOVA檢驗(yàn)法及t檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UVB照射及加入阿司匹林對(duì)細(xì)胞活性的影響

MTT法檢測(cè)單純加入不同濃度阿司匹林（3，30，300μmol/L，3mmol/L）對(duì)細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)低劑量的（3μmol/L）阿司匹林可增加細(xì)胞活性，高濃度的（30，300μmol/L，3mmol/L）阿司匹林反而使細(xì)胞活性降低，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇3μmol/L的阿司匹林作為抗氧化劑（圖1A）。對(duì)于單純進(jìn)行UV照射的對(duì)照組，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著 UV 照射時(shí)間（0s，5s，10s，20s，30s）的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性呈下降趨勢(shì)，存活率分別為90.71%，68.60%，49.70%，37.20%，可見當(dāng)照射20s，照射能量達(dá)到80mJ/cm2時(shí)可達(dá)到半數(shù)致死量LD50。為研究阿司匹林的抗氧化損傷作用，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的紫外線強(qiáng)度范圍分別為0，20，40，80mJ/cm2。實(shí)驗(yàn)組（UV+3μmol/L 阿司匹林），細(xì)胞存活率分別為91.60%，87.19%，76.19%（圖1B），明顯高于對(duì)照組（單純UV照射）。

2.2 UVB照射及阿司匹林對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

通過流式細(xì)胞儀，采用Annexin V-EGFP/PI雙染檢測(cè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組凋亡率，結(jié)果提示，UVA照射晶狀體上皮細(xì)胞主要產(chǎn)生的是早期（<4h）或晚期（>20h）凋亡機(jī)制，然而UVB和UVC僅表現(xiàn)為晚期凋亡（24～48h）機(jī)制［4］。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)平行樣，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后取均值，可見隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞的凋亡率逐漸增加19.26%，21.93%，23.77%，經(jīng)ANOVA方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在應(yīng)用阿司匹林后細(xì)胞凋亡率較相同照射劑量組有所下降分別為16.45%，17.633%，21.486%。t檢驗(yàn)分析加藥前后5s組及10s組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。20s組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2。表明凋亡細(xì)胞過多時(shí)阿司匹林將無法緩解。

2.3 UVB照射及加入阿司匹林對(duì)小窩蛋白1mRNA（cav-1mRNA）表達(dá)量的影響

Real-time RT-PCR法檢測(cè)紫外線照射不同劑量及加入阿司匹林后cav-1mRNA表達(dá)水平的變化。每組劑量取3個(gè)平行樣，采用Livak法的變化形式“用參照基因的△CT 法 2CT（參照基因）-CT（目標(biāo)基因）”來表示目的基因表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的變化。對(duì)照組（單純UVB照射）cav-1mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。ANOVA單因素方差分析照射不同劑量與空白對(duì)照的差異，如圖3所示，顯示5s，10s，20s組P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組（UVB+ASA）與對(duì)照組（單純UVB照射組）cav-1mRNA的表達(dá)量，如表1所示，5s組，10s組P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；20s組P>0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到20s時(shí)，加藥組和對(duì)照組cav-1mRNA表達(dá)水平無差別，阿司匹林不能使cav-1mRNA表達(dá)水平提高。

3 討論

自然界中的紫外線根據(jù)其生物作用分為短波紫外線 UVC（200～280nm）；中波紫外線 UVB（280～320nm）；長(zhǎng)波紫外線UVA（320～400nm）。臭氧層能夠吸收全部UVC和部分UVB，而不吸收UVA。到達(dá)地表的紫外線中，部分UVB被角膜吸收，其余的UVA和UVB可穿過角膜和房水，被晶狀體吸收。盡管臭氧層遭到破壞，但臭氧即使在含量很小的情況，也能完全吸收UVC。所以，臭氧層的破壞，主要是引起環(huán)境中UVB的顯著增加。而到達(dá)眼的紫外線中，UVB被認(rèn)為具有最強(qiáng)的生物損傷性［5］。Andley等［6］用單頻輻射光照射人晶狀體上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)297nm、313nm、325nm、334nm和365nm紫外線的細(xì)胞殺傷力逐漸下降，所以研究UVB，特別是295～320nm波長(zhǎng)區(qū)域的紫外線，更具有生態(tài)學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。

表1應(yīng)用阿匹林前后小窩蛋白-1mR N A相對(duì)β-a c t i n表達(dá)量的變化（±s，n=3）T a b.1T h e e x p r e s s i o n o fC a v e o l i n-1mR N Ar e l a t i v e t oβ-a c t i nc h a n g e s a f t e r a d d i n g a s p i r i n（±s，n=3）Group 0s 5s 10s 20s Control group 0.058±0.046 0.0403±0.0015 0.0293±0.0057 0.02567±0.002Experimental group 0.068±0.000571） 0.0550±0.00441） 0.0400±0.00261） 0.02300±0.0011）P ＜ 0.05vs control group.

小窩蛋白可引起信號(hào)分子的變構(gòu)或共價(jià)修飾，對(duì)大多數(shù)信號(hào)分子發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但新近發(fā)現(xiàn)小窩蛋白并不單純是一個(gè)信號(hào)分子的抑制劑，其對(duì)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程亦起到促進(jìn)作用［7，8］。經(jīng)過高糖處理過的晶狀體上皮細(xì)胞小窩蛋白1的表達(dá)量下降，凋亡增加，表明小窩蛋白1可抑制凋亡［9］。然而Liu等［10］認(rèn)為在用十字孢堿誘導(dǎo)凋亡的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)，過表達(dá)的小窩蛋白1使細(xì)胞細(xì)胞凋亡率增加，可能與其抑制PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和激活caspase-3有關(guān)。小窩蛋白1敲除的小鼠表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞增生，胚胎成纖維細(xì)胞表型的增加，表明小窩蛋白具有抗細(xì)胞增殖的能力［11，12］。相反的，Timme等［13］則認(rèn)為前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的小窩蛋白1通過抑制蛋白質(zhì)磷酸酶的活性使AKt處于激活狀態(tài)，這種激活狀態(tài)可抑制c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此盡管小窩蛋白1被認(rèn)為是細(xì)胞表面用來區(qū)分促凋亡和抑制凋亡信號(hào)的樞紐，其對(duì)凋亡的調(diào)控作用還存在很多爭(zhēng)議［14］。UV照射通過激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致凋亡。Daniela等發(fā)現(xiàn)用20J/m2的UVC刺激兔晶狀體上皮細(xì)胞NIH3T3，就足夠激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而導(dǎo)致了小窩蛋白1酪氨酸發(fā)生了磷酸化。因此小窩蛋白的酪氨酸磷酸化可能在UV導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中重要作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)隨著UVB照射劑量的加大，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率增加，小窩蛋白1mRNA的表達(dá)水平有所下降，可以推測(cè)小窩蛋白1在氧化損傷條件下具有一定抑制凋亡的作用。

氧化損傷導(dǎo)致谷胱甘肽的消耗，線粒體功能的破壞，過氧化物及羥基游離基等產(chǎn)生，這些物質(zhì)的產(chǎn)生最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。阿司匹林可以減少谷胱甘肽的消耗，但是無法阻止過氧化物導(dǎo)致的線粒體去極化，這種抗氧化損傷作用與我們熟知的阿司匹林對(duì)COX的抑制作用不同。它是通過細(xì)胞的離子代謝途徑來調(diào)節(jié)caspase活性，影響細(xì)胞凋亡，從而起到抗氧化損傷作用的?；颊咝g(shù)后經(jīng)常滴非甾體類抗炎藥來抗炎止痛，但是過量應(yīng)用該類藥物可能會(huì)導(dǎo)致角膜溶解和角膜穿孔等副作用［17］?？诜⑺酒チ謱?duì)白內(nèi)障有抑制作用同時(shí)也存在風(fēng)險(xiǎn)［18］。用3mmol/L的阿司匹林處理小鼠的晶狀體，3～5d后晶體出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，而使用低濃度0.3～3μmol/L處理的晶體還保持透明［19］。研究發(fā)現(xiàn)高濃度的阿司匹林可以激活caspase-3，而caspase-3的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。低濃度阿司匹林可以減少caspase-3的活性，因此找到一個(gè)既不會(huì)影響細(xì)胞功能，又能達(dá)到防止氧化損傷的劑量范圍很重要?？梢?，研究阿司匹林對(duì)晶體上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用，有望為白內(nèi)障的臨床藥物治療開辟新的前景。

本研究表明紫外線UVB照射對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞具有促凋亡作用，小窩蛋白1作為一種重要的膜蛋白可能參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。阿司匹林這一抗氧化劑在低濃度情況下具有保護(hù)晶狀體免受氧化損傷，抑制凋亡，提高小窩蛋白-1mRNA水平的作用。

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（編輯孫憲民，英文編輯王又冬）

A Decrease ofCaveolin-1mRNA Level in Human Lens Epithelial Cells Is Associated with the UV Radiationinduced Oxidative Stress

ZHAO Fang-kun1，ZHAO Jiang-yue1，LI Qin2，YU Jia-ming1，LIU Qiu-fang3，ZHAO Xun4，ZHANG Jin-song1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110005，China；2.Center Laboratory，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；3.Toxicology Department，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Center of Experiment and Technology，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the relationship between the expression ofCaveolin-1and apoptosis in human lens epithelial cells（LECs）after UV radiation and demonstrate the function of aspirin as an antioxidant.MethodsHuman lens epithelial cells SRA01/04were treated with UV 4.43mw/cm2（irradiation time 0，5，10，20seconds）.According to adding the anti-oxidant aspirin or not，the cells were divided into control and experimental group.MTT assay was used to detect the cell activity.The apoptosis rate was measured by flow cytometry.The expression ofCaveolin-1mRNA was examined by quantitative real-time RT-PCR.ResultsWith the prolonged UV radiation time，MTT measurement showed declined cell activity.Apoptosis rate was increased.Real time RT-PCR indicated decreasingCaveolin-1mRNA expression.After adding a certain concentration of aspirin，cell activity increased.In 5s and 10s groups，the expression ofCaveolin-1mRNA increased，as well as less apoptotic cells were detected compared to the control group（P<0.05），but when the radiation time reached 20s，the apoptosis rate and theCaveolin-1mRNA showed no changes compared to the control group（P>0.05）.ConclusionUV irradiation reduces the viability of cells，the level ofCaveolin-1mRNA expression，while increases apoptosis rate in LECs.Aspirin as an antioxidant can reverse this oxidative stress to some extent.But large doses of aspirin（>30μmol/L）will display the opposite function.So，to find a safe dose range also needs further study.

UV；Caveolin-1；apoptosis；aspirin；lens epithelial cell

R77

A

0258-4646（2011）02-0126-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0951.006

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872836）（30800651）

趙芳坤（1985-），女，碩士研究生.

張勁松，E-mail：cmu4h_zjs@126.com

2010-12-28