姚鵬，丁遠(yuǎn)遠(yuǎn)，馬佳明，蔣晶晶，張錦，孟凌新

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.疼痛科；2.麻醉科，沈陽(yáng) 110004）

NR1磷酸化在神經(jīng)生長(zhǎng)因子加劇大鼠骨癌痛中的作用

姚鵬1，丁遠(yuǎn)遠(yuǎn)1，馬佳明1，蔣晶晶2，張錦2，孟凌新1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.疼痛科；2.麻醉科，沈陽(yáng) 110004）

目的探討骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）表達(dá)及NR1磷酸化情況，并觀察鞘內(nèi)注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體（anti-NGF）對(duì)NR1磷酸化及骨癌痛大鼠疼痛行為的影響。方法 檢測(cè)骨癌痛大鼠DRG NGF的表達(dá)及NR1磷酸化：雌性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)（sham）組及cancer組，每組10只，分別在左脛骨注射PBS液或walker256瘤細(xì)胞，21d取左側(cè)L4-5DRG。檢測(cè)anti-NGF對(duì)NR1磷酸化及大鼠疼痛行為的影響：骨癌痛大鼠鞘內(nèi)置管，隨機(jī)分成生理鹽水（NS）組及anti-NGF組，于接種瘤細(xì)胞16d開始分別鞘內(nèi)注射生理鹽水或anti-NGF。于接種瘤細(xì)胞前、接種后13、18及21d進(jìn)行疼痛行為測(cè)試，接種21d取大鼠左側(cè)L4-5DRG，Western blot方法檢測(cè)NR1磷酸化。結(jié)果 與sham組比較，cancer組大鼠DRG NGF表達(dá)顯著上調(diào)，NR1磷酸化水平增加（P<0.01）。鞘內(nèi)注射anti-NGF后，與NS組比較，機(jī)械痛閾降低和熱輻射潛伏期延長(zhǎng)。NS組NR1磷酸化水平高于anti-NGF組（P<0.05）。結(jié)論anti-NGF減弱骨癌痛、抑制NR1磷酸化，提示NGF通過NR1磷酸化加劇大鼠骨癌痛。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子；N-甲基-D-天冬氨酸受體；磷酸化；骨癌痛

腫瘤患者發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，Thun等［1］2010年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：腫瘤已成為危及人類生命的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%～90%的腫瘤患者發(fā)生癌痛，乳腺癌、前列腺癌及肺癌等腫瘤容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移而引起骨癌痛，我們前期的研究［2］顯示，大鼠脛骨注射walker256瘤細(xì)胞誘發(fā)的骨腫瘤模型中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）加劇骨癌痛，大鼠鞘內(nèi)注射抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體（nerve growth factor polyclonal antibodies，anti-NGF） 可明顯抑制骨腫瘤引起的痛敏。

NGF 在炎性疼痛［3］和神經(jīng)病理性疼痛［4］中發(fā)揮重要作用。電生理研究發(fā)現(xiàn)：傷害性感受器的興奮性與NGF的含量密切相關(guān)。NGF不僅可直接活化感覺神經(jīng)元，還可調(diào)控一些神經(jīng)遞質(zhì)、受體、通道的活性。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體在炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用［5］，Traynelis等［6］也總結(jié)了 NGF 對(duì) NMDA受體的調(diào)制作用，但是在骨癌痛中是否存在這樣的調(diào)制作用尚不清楚。

我們推測(cè)NGF可以上調(diào)脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）NMDA 受體 NR1亞單位，因此本研究探討骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)NGF表達(dá)及NR1磷酸化情況，并觀察鞘內(nèi)注射anti-NGF對(duì)NR1磷酸化及骨癌痛大鼠疼痛行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠，體質(zhì)量200～220g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物室提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于鋪墊鋸末塑料盒內(nèi)，每籠5只飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±0.5）℃，濕度40%～60%，自然照明，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法

1.2.1 骨癌痛大鼠DRG NGF的表達(dá)及NR1磷酸化：雌性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)（sham）組及cancer組，分別在左脛骨注射PBS液或walker256瘤細(xì)胞，方法參照文獻(xiàn)［2］的實(shí)驗(yàn)方法，每組10只，21d取左側(cè)L4-5DRG。

1.2.2 Anti-NGF對(duì)NR1磷酸化及大鼠疼痛行為學(xué)的影響：骨癌痛大鼠接種瘤細(xì)胞13d鞘內(nèi)置管，隨機(jī)分成生理鹽水（NS）組及anti-NGF組，每組10只，于接種瘤細(xì)胞16d開始分別鞘內(nèi)注射生理鹽水（10μl/只）或 anti-NGF（10μl/只，用生理鹽水稀釋為 1μg/μl），每日 2次，連續(xù) 5d。于接種瘤細(xì)胞前、接種后13、18及21d觀察熱輻射縮爪潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）及機(jī)械性縮爪閾值（paw withdrawal threshold，PWT），接種21d測(cè)試后取大鼠左側(cè)L4-5DRG，Western blot方法檢測(cè)NR1磷酸化。

1.3 主要儀器和試劑

walker 256細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供），von Frey細(xì)絲（美國(guó) Stoeling公司），BME-410A熱輻射刺激儀（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所），銀汞混合器（北京四泰新技術(shù)開發(fā)公司），兔抗NGF，anti-NGF及P-NR1抗血清（Santa Cruz公司）。

1.4 瘤細(xì)胞提取

walker 256細(xì)胞為來源于大鼠乳腺癌的腹水瘤細(xì)胞，保存在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室液氮罐中，用快融方法復(fù)蘇并接種于大鼠腹腔傳代，抽取腹水、離心、計(jì)數(shù)。

1.5 大鼠脛骨癌痛模型的建立及鞘內(nèi)置管

采用以往的方法［2］建立大鼠脛骨骨癌痛模型。水合氯醛麻醉（10%，3.5×10-3ml/g）大鼠脛骨骨髓腔緩慢注入10μl含walker256的PBS細(xì)胞懸液，共含癌細(xì)胞1×105個(gè)，注射時(shí)間為2min，注射完畢后迅速用銀汞合劑封住針孔，分別用75%乙醇和無菌生理鹽水沖洗切口，皮膚分層縫合。sham組大鼠左側(cè)脛骨上段注入等體積的PBS液，其余操作同cancer組。鞘內(nèi)置管采用PE-10導(dǎo)管，L2-3椎間隙置管，導(dǎo)管尖端置于接近L5DRG位置，取無感覺和運(yùn)動(dòng)障礙的動(dòng)物作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)確認(rèn)導(dǎo)管尖端的正確位置［7］。

1.6 PWL及PWT測(cè)定

測(cè)定熱輻射刺激引起的縮爪潛伏期，將大鼠置入觀察籠內(nèi)，待其安靜后將光輻射焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)足趾底中部，打開光源，從照射開始至大鼠抬腿或逃走的潛伏期作為熱痛閾值，測(cè)定3次，時(shí)間間隔10min，取其平均值。為防止?fàn)C傷，將PWL的上限值定為20s；機(jī)械測(cè)試時(shí)大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開von Frey細(xì)絲時(shí)立即出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽(yáng)性反應(yīng)，直到找到1個(gè)纖維細(xì)絲，用其連續(xù)測(cè)試5次中有3次陽(yáng)性反應(yīng)，認(rèn)定其為閾值（g），最高閾值設(shè)為26g，前后兩次不同刺激間隔10s。

1.7 Western blot檢測(cè)

大鼠接種瘤細(xì)胞后21d，水合氯醛麻醉，斷頭處死，取左側(cè)L4-5DRG。應(yīng)用凱基生物試劑盒（KGP350）提取胞膜蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。按每孔40μg總蛋白煮沸變性后上樣，SDSPAGE電泳（成層膠濃度5%，分離膠濃度10%）分離蛋白，4℃，200mA，2h濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別與封閉液稀釋的 P-NR1抗血清（1∶1000）或 NGF抗體（1∶1000），4℃孵育過夜。然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG（1∶2000）室溫雜交2h，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)或單因素方差分析，繼以LSD或SNK處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨癌痛誘導(dǎo)NGF表達(dá)上調(diào)及NR1磷酸化

NGF在cancer組大鼠DRG表達(dá)顯著上調(diào)，與sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；cancer組大鼠DRG NR1磷酸化水平也顯著高于sham組。提示骨癌痛誘導(dǎo)NGF表達(dá)及NR1磷酸化水平上調(diào)。見圖 1，2。

2.2 anti-NGF減弱機(jī)械和熱痛敏并降低NR1磷酸化水平

大鼠脛骨接種瘤細(xì)胞前（基礎(chǔ)值）PWL和PWT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，接種13d，PWL縮短，PWT降低，大鼠出現(xiàn)機(jī)械和熱痛敏。鞘內(nèi)注射anti-NGF后，與NS組比較，PWL 延長(zhǎng)，PWT 增高，見表 1，2。

表1骨癌痛大鼠P WL變化（±s，s）T a b.1C h a n g e s o f P WL i n b o n e c a n c e r r a t s（±s，s）Post-inoculation day 13 day 18 day 21NS 13.2±1.4 8.5±1.2 6.8±0.4 4.0±0.5Anti-NGF 13.1±1.5 8.7±1.3 9.1±0.61） 9.6±1.11）1）P<0.05vs NS group；PWL，paw withdrawal latency.Group Baseline

表2骨癌痛大鼠P WT變化（±s，g）T a b.2C h a n g e s o f P WTi n b o n e c a n c e r r a t s（±s，g）Post-inoculation day 13 day 18 day 21NS 15.9±2.4 5.5±1.1 3.9±0.6 3.7±0.6Anti-NGF 16.1±2.1 5.7±1.2 9.5±1.61） 9.8±1.21）1）P<0.05vs NS group；PWT，paw withdrawal threshold.Group Baseline

鞘內(nèi)注射NS或anti-NGF后，anti-NGF組大鼠DRG NR1磷酸化水平明顯低于NS組，結(jié)果顯示骨癌痛大鼠DRG NGF表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了NR1磷酸化水平，見圖3。

3 討論

骨癌痛是一種機(jī)制極為復(fù)雜的慢性疼痛，涉及神經(jīng)損傷所致病理性痛、瘤細(xì)胞的壓迫、缺血、細(xì)胞因子及其他炎性介質(zhì)釋放所致的炎性痛等，共同構(gòu)成骨癌痛的慢性疼痛綜合征。這種復(fù)雜的、不斷演變的疼痛類型導(dǎo)致骨癌痛很難控制。本研究中NGF在骨癌痛大鼠DRG表達(dá)顯著上調(diào)。以往的一些研究顯示NGF在炎性疼痛［3］和神經(jīng)病理性疼痛［4］中發(fā)揮重要作用，NGF可以介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)，產(chǎn)生感覺超敏，當(dāng)組織受到傷害性刺激時(shí)，NGF可以激活神經(jīng)元終末的TrkA、P75受體，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)制、活化不同的離子通道，引起中樞敏化，產(chǎn)生痛覺超敏或痛覺異常。一些基于骨腫瘤的研究顯示，腫瘤細(xì)胞在骨髓腔內(nèi)不斷生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞本身會(huì)釋放NGF；腫瘤浸潤(rùn)組織的白細(xì)胞增多，占整個(gè)腫瘤組織的80%，活化的白細(xì)胞會(huì)合成并釋放大量高濃度的生長(zhǎng)因子［8］。本研究結(jié)果提示DRG也存在NGF的高表達(dá)。

NMDA受體是一種配體門控型Ca2＋通道，在傷害性疼痛信號(hào)傳導(dǎo)、整合過程中發(fā)揮重要作用，而NR1是NMDA受體的功能性亞單位，代表NMDA受體的活性狀態(tài)。有研究顯示［9］，大鼠DRG神經(jīng)元中約90%顯示NMDA受體樣免疫染色陽(yáng)性，提示外周NMDA受體在疼痛產(chǎn)生過程中可能起重要作用。本研究中骨癌痛大鼠DRG NR1磷酸化水平增高，顯示磷酸化NR1參與骨癌痛的產(chǎn)生和維持過程，這與以往在炎性痛和神經(jīng)病理性痛模型的研究結(jié)果一致［5］。

本研究同時(shí)顯示鞘內(nèi)注射anti-NGF減弱骨癌痛的機(jī)械和熱痛敏，與Sevcik等［10］腹腔內(nèi)注射anti-NGF緩解小鼠骨肉瘤疼痛的結(jié)果一致。疼痛行為學(xué)結(jié)果提示NGF參與大鼠骨癌痛的傷害性信號(hào)由外周向中樞的傳遞過程，加劇骨腫瘤誘發(fā)的疼痛。另外，anti-NGF顯著抑制骨腫瘤誘導(dǎo)的NR1磷酸化水平。這一結(jié)果提示NGF表達(dá)上調(diào)增加了NR1的磷酸化，從而促進(jìn)骨腫瘤誘發(fā)的疼痛反應(yīng)，而anti-NGF緩解骨癌痛可能與抑制了NR1的磷酸化有關(guān)。然而，由于骨癌痛的復(fù)雜性及NGF的多效性，阻斷NGF通路，其產(chǎn)生的反應(yīng)也是復(fù)雜的［11］，NGF加劇骨癌痛，但并不能排除有其他信號(hào)傳導(dǎo)通路的參與。Zou等［12］研究顯示PKC抑制劑有明顯的抗傷害感受作用，且其作用與抑制NR1的磷酸化有關(guān)，提示NR1磷酸化受PKC的調(diào)制。以往研究顯示［13］骨髓發(fā)出的感覺傳入神經(jīng)纖維86%是降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）神經(jīng)纖維，而幾乎所有表達(dá)CGRP的纖維都表達(dá)TrkA。因此，骨腫瘤時(shí)局部釋放大量的NGF與TrkA結(jié)合，激活肽能傷害感受器，促進(jìn)CGRP的釋放，通過PKC途徑調(diào)制NR1亞單位磷酸化。另外，NMDA受體同時(shí)也存在于脊髓背角及上位中樞，傳遞、整合傷害性信息，我們將在今后的研究中進(jìn)一步探討NGF、NR1亞單位磷酸化在骨癌痛敏化過程中的中樞作用。

綜上，anti-NGF減弱骨癌痛、抑制NR1磷酸化，提示NGF通過NR1磷酸化加劇大鼠骨癌痛。

［1］Thun MJ，DeLancey JO，Center MM.The global burden of cancer：priorities for prevention［J］.Carcinogenesis，2010，31（1）：100-110.

［2］姚鵬，張錦，蔣晶晶，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)骨癌痛大鼠疼痛行為學(xué)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，39（12）：1009-1012.

［3］Mousa SA，Cheppudira BP，Shaqura M，et al.Nerve growth factor governs the enhanced ability of opioids to suppress inflammatory pain［J］.Brain，2007，130（Pt 2）：502-513.

［4］Fukui Y，Ohtori S，Yamashita M，et al.Low affinity NGF receptor（p75neurotrophin receptor）inhibitory antibody reduces pain behavior and CGRP expression in DRG in the mouse sciatic nerve crush model［J］.J Orthop Res，2010，28（3）：279-283.

［5］Gao X，Kim HK，Chung JM，et al.Reactive oxygen species（ROS）are involved in enhancement of NMDA-receptor phosphorylation in animal models of pain［J］.Pain，2007，131（3）：262-271.

［6］Traynelis SF，Wollmuth LP，McBain CJ，et al.Glutamate receptor ion channels：structure，regulation，and function ［J］.Pharmacol Rev，2010，62（3）：405-496.

［7］Tsuda M，Masuda T，Kitano J，et al.IFN-gamma receptor signaling mediates spinal microglia activation driving neuropathic pain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（19）：8032-8037.

［8］Zhang F，Lu W，Dong Z.Tumor-infiltrating macrophages are involved in suppressing growth and metastasis of human prostate cancer cells by INF-beta gene therapy in nude mice［J］.Clin Cancer Res，2002，8（9）：2942-2951.

［9］Marvizón JC，McRoberts JA，Ennes HS，et al.Two N-methyl-D-aspartate receptors in rat dorsal root ganglia with different subunit composition and localization［J］.J Comp Neurol，2002，446（4）：325-341.

［10］Sevcik MA，Ghilardi JR，Peters CM，et al.Anti-NGF therapy profoundly reduces bone cancer pain and the accompanying increase in markers of peripheral and central sensitization［J］.Pain，2005，115（1-2）：128-141.

［11］Zhang RX，Liu B，Wang L，et al.Spinal glial activation in a new rat model of bone cancer pain produced by prostate cancer cell inoculation of the tibia［J］.Pain，2005，118（1-2）：125-136.

［12］Zou X，Lin Q，Willis WD，et al.Effect of protein kinase C blockade on phosphorylation of NR1in dorsal horn and spinothalamic tract cells caused by intradermal capsaicin injection in rats ［J］.Brain Res，2004，1020（1-2）：95-105.

［13］Walsh GS，Krol KM，Kawaja MD.Absence of the p75neurotrophin receptor alters the pattern of sympathosensory sprouting in the trigeminal ganglia of mice overexpressing nerve growth factor［J］.J Neurosci，1999，19（1）：258-273.

（編輯武玉欣，英文編輯王又冬）

Roles of NMDA Receptor NRl Subunit Phosphorylation on Nerve Growth Factor-facilitated Bone Cancer Pain in Rats

YAO Peng1，DING Yuan-yuan1，MA Jia-ming1，JIANG Jing-jing2，ZHANG Jin2，MENG Ling-xin1
（1.Department of Pain，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Anaesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of nerve growth factor（NGF）and NMDA receptor NR1subunit phosphorylation and investigate the effects of anti-NGF on dorsal root ganglion（DRG）NR1phosphorylation and pain in the rats with bone cancer pain.MethodsTwenty rats were randomly divided into sham and cancer group（n=10per group）by inoculating PBS or walker256cancer cell solution into the left tibia.On day 21，the left lumbar 4-5DRG were removed for detecting the expression of NGF and phosphorylated NR1with Western blot.Cancer rats，in which the intrathecal catheter were surgically implanted，were randomly assigned to NS and anti-NGF group （n=10per group）.Intrathecal injection of saline or anti-NGF was given from day 16to 21after inoculation.Mechanical and thermal hyperalgesia was assessed before inoculation （baseline），on day 13，18and 21after inoculation.After the behavioral test on day 21，the left lumbar 4-5DRG were removed to measure phosphorylated NR1with Western blot.ResultsThe expression of NGF and the levels of phosphorylated NR1were significantly up-regulated in the DRG of the cancer group rats compared with those of sham group.Intrathecal injection of anti-NGF attenuated the mechanical and thermal hyperalgesia compared with the rats of group NS，a reduced tendency in paw withdrawal latency（PWL）and a decreased paw withdrawal threshold（PWT）were observed in anti-NGF group rats.Phosphorylated NR1levels were significantly higher in NS group rats than anti-NGF group rats，which indicated that anti-NGF inhibited DRG NR1phosphorylation during bone cancer pain.ConclusionAnti-NGF might attenuate bone cancer pain and inhibit NR1phosphorylation，which indicated that NGF could enhance NR1phosphorylation to facilitate bone cancer pain.

nerve growth factor；N-methyl-D-aspartate receptor；phosphorylation；bone cancer pain

R738

A

0258-4646（2011）02-0117-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.005

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20082111）

姚鵬（1971-），男，講師，博士.

張錦，E-mail：jinzhang_cmu2h@yahoo.com.cn

2010-11-23