張立堅,張俊杰,張良滔,蔡 春

(廣東醫(yī)學(xué)院分析中心,廣東湛江 524023)

液相色譜-質(zhì)譜法檢測漁業(yè)養(yǎng)殖水中硝基呋喃及氯霉素藥物

張立堅,張俊杰,張良滔,蔡 春

(廣東醫(yī)學(xué)院分析中心,廣東湛江 524023)

建立了同時測定漁業(yè)養(yǎng)殖水中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮及氯霉素等5種抗生素藥物的超高壓液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)分析方法。水樣用 HLB萃取柱凈化、濃縮后,洗脫液經(jīng)氮氣吹干,殘渣用V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液溶解,以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相,經(jīng)ZORBAX SB-C18色譜柱分離后,用串級質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式做定性定量分析。該方法在0.5μg/L或1～40μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性,相關(guān)系數(shù)均大于0.996,檢出限(S/N=3)為0.5～1μg/L,平均回收率為90.3%～104.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%～10.0%。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS);硝基呋喃;氯霉素;固相萃取;漁業(yè)用水

硝基呋喃和氯霉素(chlo ramphenicol,CAP)是兩類人工合成的廣譜抗生素。硝基呋喃類藥物中常見的品種有呋喃唑酮(furazolidone,FZD)、呋喃西林(nitrofarazone,NFZ)、呋喃妥因(nitrofarantoin,NFT)和呋喃它酮(furaltadone FTD)等4種。這兩類抗生素常用于動物各種傳染性疾病的治療,對多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用,曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用,同時也帶來了水產(chǎn)品中的藥物殘留。硝基呋喃類藥物及其代謝物具有潛在的致癌和誘導(dǎo)突變作用;氯霉素能抑制人體骨髓造血功能,引起人類的再生障礙性貧血,粒狀白細(xì)胞缺乏癥,新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病,低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性。因此,我國及世界各國均禁止這兩類藥物在所有食品動物養(yǎng)殖中使用[1-2]。由于這兩類藥物具有高效價廉的特點,在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中仍然可能存在非法使用和誤用的情況。為確保漁業(yè)無害養(yǎng)殖,實現(xiàn)從目標(biāo)監(jiān)控向過程監(jiān)管的轉(zhuǎn)變,加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程的應(yīng)用藥物監(jiān)測和規(guī)范管理,控制違禁藥物的使用和誤用,保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全,對養(yǎng)殖場的水質(zhì)進(jìn)行實時監(jiān)控就顯得非常重要。

硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝迅速,其代謝物以組織結(jié)合蛋白的形式持續(xù)存在。因此,目前許多報道的方法都主要是針對動物性食品中硝基呋喃類的代謝物進(jìn)行檢測[3-4]。但是,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中硝基呋喃類藥物的非法使用主要是直接撒入養(yǎng)殖水中,對養(yǎng)殖水中原藥的檢測可以從源頭上監(jiān)控其非法使用。目前原藥的檢測方法主要用于飼料及獸藥中[5],氯霉素的檢測也主要針對海產(chǎn)品等動物源性食品[2,6],并未見漁業(yè)養(yǎng)殖水中硝基呋喃類原藥和氯霉素同時檢測的報道。本研究建立漁業(yè)養(yǎng)殖水中硝基呋喃類及氯霉素兩類藥物5種組分的樣品前處理方法和超高壓液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法(UPLC-ESIM S/M S),希望可有效應(yīng)用于養(yǎng)殖場水質(zhì)的監(jiān)測,保證水產(chǎn)養(yǎng)殖的無害生產(chǎn)。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

1200SL超高壓液相色譜儀(配有 G1312B二元泵、G1322A脫氣機(jī)、G1329B自動進(jìn)樣器),串聯(lián)6430B三重四極桿質(zhì)譜儀:美國Agilent公司產(chǎn)品,配有電噴霧電離源及M asshunter工作站;M S2型漩渦振蕩器:德國 IKA公司產(chǎn)品;Sigma 3K15臺式高速冷凍離心機(jī):德國Sigma公司產(chǎn)品;M illi-Q超純水器:美國M illipore公司產(chǎn)品;Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL):美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮及氯霉素(標(biāo)準(zhǔn)品,純度 ≥98.5%):德國 D r.Ehrensorfer公司產(chǎn)品。上述標(biāo)準(zhǔn)品均配成 10 mg/L單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18℃以下保存,臨用前用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純):德國 Merck公司產(chǎn)品;實驗用水為超純水;其他試劑為分析純。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Aglient ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm ×50 mm ×1.8μm);流動相:0.1%甲酸-水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脫條件:0 min、30%B,0.5 min、30%B,1 min、65%B,1.5 m in、85%B,2 m in、100%B,2.5 min、100%B,3 min、30%B;流速 0.3 m L/min;進(jìn)樣量5μL;柱溫25 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離方式:呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮為正離子模式,呋喃妥因、氯霉素為負(fù)離子模式;離子源溫度300℃;脫溶劑氣溫度350℃;脫溶劑氣流速11.0 m L/min;多反應(yīng)監(jiān)測模式(M RM);其他參數(shù)列于表1。

表1 5種化合物的 UPLC-MS/MS儀器參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 5 compounds

1.4 樣品前處理

HLB固相萃取柱依次用1 m L甲醇和1 mL水活化,取10 m L水樣,以1 mL/min速度過柱,再依次用1 m L 5%甲醇-水溶液淋洗小柱,用2 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫并收集洗脫液,氮氣吹干 ,加 200μLV(乙腈) ∶V(水)=1 ∶1混合溶液,漩渦振蕩溶解,以15 000 r/min離心5 min,取上清液,待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取0.1 mg/L呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮及氯霉素單標(biāo)溶液,不過柱直接進(jìn)樣,在正、負(fù)離子模式下做全掃描,選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式;再對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,得到碎片離子信息,選取豐度最強(qiáng)和次之的離子作為各組分的定量和定性檢測離子,并根據(jù)質(zhì)譜圖的靈敏度選擇電離源的正負(fù)檢測模式。結(jié)果表明:呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮選擇正離子模式;呋喃妥因、氯霉素選擇負(fù)離子模式。然后對各組定性和定量離子的錐孔電壓及碰撞氣能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使分子離子與特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大。

2.2 色譜條件選擇

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)下電離,因此流動相的組成和添加劑不但影響目標(biāo)化合物的保留時間和峰形,還會影響目標(biāo)化合物的離子化效率,從而影響靈敏度。本研究分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動相對靈敏度和分離度的影響,結(jié)果表明,采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相有較好的色譜分離和分析靈敏度。5種化合物在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的特征離子質(zhì)量色譜圖示于圖1。

圖1 5種化合物在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of 5 com pounds under multiple reaction monitoringmode

由標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 和40.0μg/L 混標(biāo)溶液 ,按照上述條件進(jìn)行UPLC-MS/M S分析,5種藥物在0.5μg/L或1～40μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性方程及相關(guān)系數(shù)列于表2。由表2可見,本方法測定的5種抗生素線性范圍寬、靈敏度高。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

在空白水樣中添加5種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別按信噪比(S/N)大于10和信噪比大于3計算本方法的定量限(LOQ)和檢出限(LOD),結(jié)果列于表2。

2.4 回收率與精密度

在不含有這5種抗生素的水樣中分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成5、10和20μg/L 3種水平的水樣,取10 m L按照1.4的方法進(jìn)行處理,每個添加水平平行重復(fù)測定5次。5種抗生素的平均回收率為90.3%～104.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%～10.0%,結(jié)果列于表3。

表2 5種化合物測定的工作曲線、相關(guān)系數(shù)、定量下限及檢出限Table 2 Regression equations,correlation coefficients,quantitation limitsand detection limits of 5 compounds

表3 方法的回收率與精密度(n=5)Table 3 Recoveriesand precisions in sam ples(n=5)

3 結(jié)論

本試驗建立了超高壓液相色譜-串級質(zhì)譜測定漁業(yè)養(yǎng)殖水中硝基呋喃類和氯霉素兩類抗生素共5種組分的同時分析方法,在優(yōu)化的試驗條件下,5種抗生素經(jīng) HLB柱萃取、ZORBAX SBC18柱分離,運用LC-M S/M S在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性和定量的分析。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好的特點,適用于漁業(yè)養(yǎng)殖水中5種抗生素的測定。

[1]朱 堅:高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測肉和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報,2003,24(增刊):121-122.

[2]賀利民,曾振靈,劉雅紅,等.氯霉素類三甲基硅衍生物的質(zhì)譜特征及其殘留監(jiān)測[J].質(zhì)譜學(xué)報,2004,25(2):95-96.

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[6]毛麗莎,劉紅河,劉桂華,等:動物源性食品中氯霉素殘留量的檢測方法研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)2010,37(6):1 123-1 125.

Determination of 4 Nitrofuransand Chloram phen icol in Fisheries Water by Liquid Chromatography Coupled Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Li-jian,ZHANG Jun-jie,ZHANG Liang-tao,CA IChun
(A na lysis Center of Guangdong M edica l College,Zhanjiang 524023,China)

An ultra high-p ressure liquid chromatography coup led electrosp ray ionization triple-quadrup le tandem mass spectrometry(UPLC-ESIMS/M S)was used for the simultaneous determination of furazolidone , nit rofarazo ne , nit rofarantoin , furaltadone and chloramp henicol in fisheries water.The drugs were extracted and cleaned up by Oasis HLB solid phase extraction cartridge.The extract was evapo rated to dryness under nitrogen and reconstituted in solution withV(acetonitrile)∶V(water)=1∶1.The 5 drugs were separated and detected by ZORBAX SB-C18 using 0.1%formic acid(A)and acetonitrile(B)asmobile phase.The target compoundsw ere confirmed and quantified by M S/M S under multiple reactions monitoring(MRM)mode with external standard method.Under the optimal condition,the calibration curves of 5 drugs show good linearity with the correlation coefficients rather than 0.997 in the range of 0.5μg/L or 1—40μg/L,the limits of detection(LODs)range from 0.5—1.0μg/L(S/N=3),the average recoveries of 5 drugs are in the range of 90.3%—104.2%,and the relative standard deviations(RSDs)are 5.4%—10.0%.

liquid chromatography coup led tandem mass spectrometry(LC-M S/M S);nitrofuran;chloramphenicol;solid phase extraction(SPE);fisheries water

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0207-04

2011-04-11;

2011-05-30

廣東省科技計劃項目(2009B020316005)資助

張立堅(1968～),女(漢族),山西人,副教授,從事藥物分析和天然產(chǎn)物研究。E-mail:gdmczlj@sina.com