宋駿，夏長勝

(1.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院檢驗科，安徽蕪湖241001;2.北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，北京100044)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為嗜肝雙鏈DNA病毒，是最重要的肝臟疾病致病因子。根據(jù)乙型肝炎病毒(HBV)全基因組序列差異≥8%或S基因序列≥4%，將HBV分為A、B、C、D、E、F、G、H等8個基因型[1，2]，同時據(jù)全基因序列異質(zhì)性≥4%而≤8%將HBV同一種基因型再分為不同的亞型[3]，如:A基因型可分為Aa和Ae亞型;B基因型可分為B1(Bj)、B2(Ba)、B3和B4亞型;C基因型可分為C1、C2、C3和C4亞型等。

據(jù)報道HBV基因型或亞型的分布呈一定的地理區(qū)域性[4]。因此，分析不同地區(qū)基因型或亞型的分布，使用分子流行病學(xué)方法研究其流行勢態(tài)對乙肝的防治具有重要意義。

皖南地區(qū)是以漢族為主的民族聚居地，有關(guān)HBV感染的基因型及亞型研究鮮有報道。本研究擬對皖南地區(qū)HBV感染者進行基因型和亞型的檢測，以期了解HBV基因型的地區(qū)分布特點及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院就診的319例HBV感染患者被納入研究，其中急性乙型肝炎10例，慢性乙型肝炎231例，肝硬化43例，肝細胞癌8例，以及無癥狀攜帶者27例。所有患者血清HBV DNA檢測為陽性。選擇患者來我院就診的首次HBV DNA陽性血清標本進行基因型及亞型檢測。

1.2 主要試劑核酸提取試劑購自Promega公司;PCR試劑購自寶生工程(大連)有限公司。

1.3 血清DNA提取嚴格按照說明書的操作進行。

1.4 引物設(shè)計參考文獻[5，6]，引物序列見表1所示;引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成。

表1 HBV型特異性引物分型法的引物序列

1.5 HBV基因型檢測HBV基因分型采用多對引物和巢式PCR法。第1輪PCR以提取的HBV DNA為模板，按95℃10 min;94℃20 s，55℃20 s，72℃1 min，擴增40個循環(huán);72℃延伸7 min。第一輪PCR產(chǎn)物作為第2輪PCR的模板，按95℃10 min;94℃20 s，65℃20 s，72℃30 s，擴增40個循環(huán);72℃延伸7 min。取第二輪PCR產(chǎn)物10 μl，經(jīng)2%瓊脂糖100V電泳20min，觀察結(jié)果。HBV各基因型產(chǎn)物為:A基因型為68 bp，B基因型為281 bp，C基因型為122 bp，D基因型為119 bp，E基因型為167 bp，F(xiàn)基因型為97 bp。

1.6 HBV亞型檢測Ba亞型:擴增前C區(qū)和C區(qū)檢測B基因型的亞型。第一輪PCR按96℃2 min;94℃15 s，55℃45 s，72℃45 s，擴增40個循環(huán);72℃延伸7 min;第二輪PCR以第一輪產(chǎn)物為模板按96℃2 min;94℃15 s，55℃45 s，72℃45 s，擴增40個循環(huán);72℃延伸7 min，取第二輪PCR產(chǎn)物10 μl，經(jīng)2%瓊脂糖100 V電泳20 min，觀察結(jié)果。Ba亞型的PCR產(chǎn)物為110 bp。Bj亞型的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件與Ba亞型相同，僅引物不同，其PCR產(chǎn)物也為110 bp。C1基因亞型:擴增P區(qū)檢測HBV C基因型的亞型。按95℃10 min;94℃15 s，55℃45 s，72℃30 s，擴增40個循環(huán);72℃延伸7 min，取PCR產(chǎn)物10 μl，經(jīng)2%瓊脂糖100V電泳20 min，觀察結(jié)果。Cl亞型的PCR產(chǎn)物大小為340 bp。C2亞型的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件與Cl亞型的相同，僅將引物反義鏈換為HBVC2R。其PCR產(chǎn)物大小為240 bp。1.7PCR直接測序?qū)CR分型產(chǎn)物測序，以確定分型的準確性。PCR產(chǎn)物純化和測序由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司完成。運用Clustal W和Blast軟件進行序列比對和同源性分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料的比較，對于多組采用方差分析和q檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV基因型及分布285例患者中，B基因型162例(57%)，C基因型49例(17%)，B+C混合基因型74例(26%)，未發(fā)現(xiàn)A、D、E、F型。HBV基因型分析，見HBV DNA擴增產(chǎn)物電泳圖1所示(圖1)。其中B基因型擴增片段為281 bp;C基因型擴增片段為122 bp。

圖1 HBV DNA基因型擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 HBV亞型檢測結(jié)果162例B基因型中以Ba亞型為主，未發(fā)現(xiàn)Bj亞型，其中Ba及Bj亞型擴增產(chǎn)物均為110 bp，無法具體區(qū)分;本研究通過基因測序確定全為Ba亞型。49例感染C基因型患者中，C1亞型38例(78%)，C2亞型9例(18%)，未分型2例(4%);C1亞型擴增產(chǎn)物340 bp，C2亞型擴增產(chǎn)物為240 bp。見HBV DNA擴增產(chǎn)物電泳圖2所示(圖2)。

圖2 HBV DNA亞型擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 HBV基因型同HBV DNA水平的關(guān)系目前認為，乙肝發(fā)病機制是HBV病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而血清中高滴度的HBV是乙肝發(fā)病的危險因素之一，HBV的復(fù)制狀態(tài)與其基因型之間有無關(guān)系存在爭議，同時HBV DNA水平作為乙型肝炎療效的主要觀察指標，具有十分重要意義。所以我們把不同基因型的HBV DNA水平做了比較。

表2 不同HBV基因型感染者血清HBV DNA水平比較

3 討論

HBV感染在世界各地均有不同程度的流行，其地區(qū)差異非常明顯。除與衛(wèi)生狀況、生活習(xí)慣、人體免疫、遺傳特征等因素明顯相關(guān)外，還與病毒本身生物學(xué)特基因型、血清亞型、基因變異等有關(guān)。我國HBV基因型主要以B基因型和C基因型為主，并有少數(shù)D基因型和A基因型，北方以C基因型為主，南方B基因型逐漸增多且為主要基因型[7]。本次對皖南地區(qū)人群HBV分子流行病學(xué)研究結(jié)果與國內(nèi)的相關(guān)報道基本符合[8]。但發(fā)現(xiàn)最顯著的特點是B+C混合基因型感染占很大比例(26%)?？赡芘c皖南地區(qū)人口稠密，近年來經(jīng)濟發(fā)展迅速且人口流動性較大，人群間生活習(xí)俗各不相同又相互影響有關(guān)。

目前，人類感染HBV病毒的基因型別可能與感染途徑、疾病的感染譜、疾病的進展有一定的相關(guān)性。在以B型和C型為主的亞洲，大量的證據(jù)表明[7，9，10]:C基因型與嚴重肝病相關(guān)，和B型相比預(yù)后較差。不同的HBV基因型可能代表著HBV變異及復(fù)制能力的不同。HBV在體內(nèi)受到機體免疫和抗病毒治療的雙重壓力，其基因突變是為了適應(yīng)外界環(huán)境變化。HBV基因變異如前C區(qū)1986、BCP區(qū)A1762T/G1764A突變等都很常見。鄧永東等[11]報道C型的BCP雙突變率明顯高于B型，推測A1762T/G1764A雙突變可能是造成C型患者比B型存在更嚴重肝損害的原因之一。

同時對皖南地區(qū)285例HBV感染者進行血清HBV DNA水平檢測，B型和C型患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但都高于B、C基因型混合感染患者，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。僅從血清HBV DNA水平難以鑒別B型和C型何者更易發(fā)展為嚴重的肝病。需要進一步的研究探討其臨床意義。

研究檢測皖南地區(qū)162例B基因型感染的患者，通過基因測序確定為Ba亞型，未發(fā)現(xiàn)Bj亞型;B基因型中以Ba亞型為主與既往研究相符[12]。49例感染C基因型患者中，C1亞型38例(78%)，C2亞型9例(18%)，未分型2例(4%)，說明該地區(qū)人群感染的C型主要為C1亞型。完成HBV基因型及亞型分布的初步調(diào)查后，進一步的研究可以從HBV基因亞型水平上探討其臨床疾病譜及抗病毒治療效果的關(guān)系。

總之，研究顯示皖南地區(qū)HBV感染人群中B基因型最流行，其次是B及C基因混合型。B基因型完全為Ba亞型，而C基因型中C1亞型為優(yōu)勢亞型。

[1]ARAUZ-RUIZ P，NORDER H，ROBERTSON BH.et al.Genotype H:a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America[J].J Gen Virol，2002，83(Pt 8):2059-2073.

[2]KATO H，F(xiàn)UJIWARA K，GISH R G.＆9 other authors(2005).Classifying genotype F of hepatitis B virus into F1 and F2 subtypes[J].World J Gastroenterol，2005，11:6295－6304.

[3]李雅娟，莊輝，李杰，等.乙型肝炎病毒基因型和亞型的分布及其與臨床的相關(guān)性[J].中華肝臟病雜志，2005，13(10):724～729.

[4]嚴艷，李卓，殷繼明，等，北京地區(qū)乙型肝炎病毒基因型及基因亞型的分布和臨床意義[J].中國誤診學(xué)雜志，2008，8(15):3537－3539.

[5]NAITO H，HAYASHI S，ABE K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39(1):362－364

[6]SUGAUCHI F，KUMADA H，SAKUGAWA H，et al.Two subtypes of genotype B(Ba and Bj)of hepatitis B virus in Japan[J].Clin Infect Dis，2004，38(9):1222－1228.

[7]DINGX，MIZOKAMI M，YAOG，et al.HePatitis B virus genotyPe distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai[J].China Intervirology，2001，44:43－47.

[8]劉娜，徐光華，馮繼紅，等.延安市乙型肝炎病毒基因型分子流行病學(xué)研究[J].延安大學(xué)學(xué)報，2009，7(2):1－4.

[9]BAESH，YOON SK，JANGJW，et al.Hepatitis B virus genotyPe C prevails among ChroniC Carriers of the virus in Korea[J].Korean Med Sci，2005，20(5):816.

[10]SAKUGAWAH，NAKASONEH，NAKAYOSHIT，et al.Preponderanee of hepatitis B virus genotype B contributes to a better Prognosis of chronic HBV infection in Okinawa，JaPan[J].Med Virol，2002，67(4):484.

[11]鄧永東，李文凡，陳青峰，等.慢性乙型肝炎病毒基因型與BCP區(qū)變異的臨床研究[J].臨床肝膽病雜志，2004，20(2):73－74.

[12]趙鴻，李俊，李興豐，等.感染乙型肝炎病毒不同基因型和亞型患者的臨床特點分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2007，28(1):74－77.