吳新海 郗文斌 屠偉峰

重組人生長激素對體外人中性粒細胞功能影響

吳新海 郗文斌 屠偉峰

目的 觀察重組人生長激素(rhGH)對有無脂多糖(LPS)刺激的離體培養(yǎng)中性粒細胞(PMNs)呼吸爆發(fā)和粘附功能的影響。方法 分離純化人外周靜脈血PMN,加或不加LPS與三個不同劑量(10 ng/ml,100 ng/m l和1000 ng/ml)的rhGH共同孵育3 h,檢測不同試驗組的PMN呼吸爆發(fā)和粘附功能。結(jié)果 低濃度的rhGH(10 ng/ml)不影響PMNs的呼吸爆發(fā)功能和粘附功能,高濃度的的rhGH (100 ng/m l,1000 ng/ml)增強PMN的呼吸爆發(fā)和粘附功能,rhGH不影響LPS刺激的PMN的呼吸爆發(fā)功能,能增強LPS刺激的PMN的粘附功能。結(jié)論 一定濃度的rhGH能活化PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能,增加LPS活化的PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附,加重炎癥反應(yīng)時PMNs對組織的損傷作用。

重組人生長激素;中性粒細胞;呼吸爆發(fā);粘附

重組人生長激素(rhGH)由于具有促進蛋白合成、加速創(chuàng)面愈合等特點,已被臨床用于燒傷、膿毒癥、大手術(shù)術(shù)后等重癥患者的輔助治療。近來研究發(fā)現(xiàn),rhGH不僅調(diào)節(jié)機體的代謝,還對免疫系統(tǒng)和免疫細胞的功能有調(diào)節(jié)作用[1]。本研究將探討rhGH對離體培養(yǎng)的中性粒細胞(PMNs)呼吸爆發(fā)、與內(nèi)皮細胞粘附的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 percoll分離液(Amersham Biosciences公司),胎牛血清(杭州四季青),RPMI-1640(Gibcol),國產(chǎn)rhGH (長春金賽藥業(yè)有限公司),內(nèi)皮細胞株(ECV-304)由南方醫(yī)科大學(xué)試驗中心饋贈;PMA和LPS購自sigma公司,NBT(上海華舜生物公司)。NAPCO 5410型CO2孵箱,biocell ht2酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 外周血PMNs的分離 取健康人外周靜脈血15ml肝素抗凝(10 u/ml),采用percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離PMNs[2]:取72%的percoll液15ml加于離心管底部,再輕輕將同體積63%的percoll液加在上面;然后將抗凝全血緩慢加在percoll之上;4℃,1800 rpm,離心25min。從分離液中取出PMNs,離心,去上清,用低滲溶漲法破除少量的紅細胞,RPMI-1640沖洗一次;用RPMI1640培養(yǎng)基(含 10%的胎牛血清, 100 u/ml的青霉素和100u/m l的鏈霉素)制成PMNs懸液,調(diào)整其濃度為 2×106/m l。經(jīng)臺盼藍排斥法證實其活力＞98%, W right-Giemsa染色鑒定其純度＞95%。

1.2.2 分組 根據(jù)有無LPS刺激及不同濃度的rhGH分6組對照組(C組);LPS(100 ng/ml)組(L組);10 ng/ml rhGH組(R 1組),100 ng/m l rhGH組(R 2組),1000 ng/ml rhGH組(R 3組)和100 ng/ml LPS+100 ng/m l rhGH組(LR組)將分組后的PMNs置37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)3 h檢測呼吸爆發(fā)和粘附。

1.2.3 ECV-304細胞株的培養(yǎng) 用RPMI1640培養(yǎng)基將ECV-304細胞株制成 1×108/l的細胞懸液,加入 24孔培養(yǎng)板中,置37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察至細胞呈鋪路石狀鑲嵌排列的單層備用。

1.2.4 PMNs呼吸爆發(fā)的檢測 參照Piva E,De Toni S等[3]的方法通過檢測NADPH氧化酶的活性代表PMNs的呼吸爆發(fā)功能:在96孔板上,每孔加入50μl(2×106ml)的PMNs懸液、50μl的PBS和50μl的PMA(1.625μmol/l),室溫震蕩孵育10min,加入NBT(24μmol/l)后,立即用酶標儀在波長490 nm的條件下測一次吸光度(A),每隔5min測一次吸光度,一直測到 30 min,每份樣本重復(fù)5次,取其平均值(A)。根據(jù)NBT的減少率來評價PMNs呼吸爆能力(NADPH氧化酶活性),計算公式為:

1.2.5 PMNs與內(nèi)皮細胞粘附率的測定 將長成單層的ECV-304的培養(yǎng)基去掉,從各組培養(yǎng)的PMNs懸液中取0.5 m l加到ECV-304之上,放入培養(yǎng)箱中孵育30min,取上清液置不同試管中,并用等量的PBS液沖洗2次,沖洗液分別放置相應(yīng)的試管中;上清液和沖洗液混均,計數(shù)脫落的PMNs。用以下公式計算PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附率:

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用表示,用SPSS12.0軟件進行組間 t檢驗,P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhGH對有無LPS刺激的PMNs呼吸爆發(fā)功能的影響

與對照組相比,10 ng/ml的rhGH與PMNs共同孵育3 h不增強PMNs呼吸爆發(fā)能力;而100 ng/m l和1000 ng/m l的rhGH與PMNs共同孵育能增強PMNs的呼吸爆發(fā)能力,但兩者之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。加入LPS刺激時,PMNs的呼吸爆發(fā)功能增強;100 ng/ml的rhGH不影響LPS刺激的PMNs呼吸爆發(fā)功能。(見表1)。

表1 各實驗組對PMNs呼吸爆發(fā)和粘附的影響

2.2 rhGH對有無LPS刺激的PMNs與內(nèi)皮細胞粘附的影響

與對照組相比,10 ng/ml的rhGh不影響PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附率,100 ng/ml的rhGH和1000 ng/m l的rhGH能增強PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附(見表1);加入LPS刺激時,PMNs的與內(nèi)皮細胞的粘附能力增強,rhGH能增加LPS刺激的PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附率。

3 討論

本試驗探討不同濃度的rhGH對離體培養(yǎng)的PMNs呼吸爆發(fā)功能及與內(nèi)皮細胞粘附的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn) rhGH能增強PMNs的呼吸爆發(fā)功能,增加與內(nèi)皮細胞的粘附率,這一作用呈劑量依賴性,只有達到一定的濃度這一影響才有統(tǒng)計學(xué)意義,但是當繼續(xù)增加rhGH的濃度時,這一作用并沒有隨之增加。

早期臨床研究發(fā)現(xiàn):生長激素(GH)依賴的身材矮小患者常伴隨有慢性肉芽腫疾病,肢端肥大癥的患者的PMNs呼吸爆發(fā)功能增強和趨化能力減弱[4],推測GH與PMNs的功能存在某種聯(lián)系,本實驗結(jié)果證實了這種假設(shè)。正常成人血漿的GH的濃度在3～5ng/ml,而肢端肥大癥患者可高達100～1000 ng/ml,所以實驗為了探討這一影響與濃度的關(guān)系,我們設(shè)置了10ng/m l、100 ng/ml、1000 ng/ml三個濃度組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的10ng/m l的rhGH不影響PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能,因此我們推測在生理狀態(tài)下分泌的 GH可能不影響PMNs的功能,只有在某些病理狀態(tài)下(如巨人癥和肢端肥大癥)或者用rhGH治療時,血清中的GH的常達到一定的濃度(＞100 ng/ml),才會對PMNs的功能產(chǎn)生影響,但1000ng/ m l的rhGH的影響并不比100 ng/ml的rhGH的更顯著;由于條件的限制,在本實驗我們只設(shè)置了三個濃度組,要闡明 rh-GH對PMNs影響的的量效關(guān)系需進一步研究。

rhGH常用于治療燒傷、膿毒癥患者,而這些患者體內(nèi)大多處于炎癥反應(yīng)狀態(tài),PMN的功能被激活;最近有研究認為ICU患者使用大劑量的rhGH治療,住院時間延長,死亡率增加[5],可能與炎癥反應(yīng)加重有關(guān);本實驗為了觀察rhGH對活化的PMNs功能的影響,我們加入LPS作為刺激劑,觀察rh-GH對LPS刺激的PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能的影響;LPS是內(nèi)毒素的主要成分,LPS可通過活化PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附等功能[6],增加機體的炎癥反應(yīng)而加重組織的損傷。在本實驗中,我們進一步證實LPS能增強PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能;而rhGH不影響LPS刺激的PMNs的呼吸爆發(fā),但能增加LPS活化的PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附率,所以用于治療重癥患者可能會加重活化的PMNs的組織的損傷;Liu等[7,8]研究也發(fā)現(xiàn),GH治療增加膿毒癥腹膜炎大鼠循環(huán)中PMN的CD11 b的表達及呼吸爆發(fā)能力并促進肺微血管的損傷;Hansen等研究認為[9],GH和IGF-1都不直接刺激內(nèi)皮細胞表達VCAM-1的作用,但 GH能通過間接調(diào)制循環(huán)中的介質(zhì)增加VCAM-1的表達,有利于PMN粘附游走到血管外,發(fā)揮組織損傷的作用。

綜上所述,rhGH能增強PMNs的呼吸爆發(fā)和與內(nèi)皮細胞的粘附;而且能增強LPS活化的PMNs與內(nèi)皮細胞的粘附;所以臨床應(yīng)用rhGH治療可增強機體的防御能力,但是當機體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)時,可能會加重PMNs對組織的損傷。

[1] Liu W,Jiang Z,WangX,et al.Impact of perioperative treatment of recombinant human growth hormoneon cell immune function and intestinal barrier function:randomized,double-blind,controlled trial. World JSurg,2003,27(4):412-415.

[2] Haslett C,Guthrie LA,Kopaniak MM,et al.Modulation ofmultiple neutrophil function by preparativemethodsor trace concentrationsof bacterial lipopolysaccharide.Am JPathol,1985,119(1):101-110.

[3] Piva E,Tonide S,Caenazzo A,et al.NeutrophilNADPH oxidase activity in chronicmyeloproliferative diseasesbymicroscopic and photometric assays.Acta Haematol,1995,94:16-22.

[4] Buescher ES,Gallin JI.Stature and weight in chronic granulomatous disease.JPediatr,1984,104(6):911-913.

[5] Takala J,Ruokonen E,Webster NR,etal.Increased mortality associated growth hormone treatmentin critically ill adults.N Engl JMed, 1999,341(11):785-792.

[6] Coimbra R,LoomisW,Melbostad H,et al.LPS-stimulated PMN activation and proinflammatorymediator synthesis is downregulated by phosphodiesterase inhibition:role of pentoxifylline.JTrauma,2004, 57(6):1157-1163.

[7] Liu Z,Yu Y,Jiang Y,et al.Growth hormone increases lung NF-kappaB activation and lung microvascular injury induced by lipopolysaccharide in rats.Ann Clin Lab Sci,2002,32(2):164-170.

[8] Liu Z,Yu Y,Jiang Y,et al.Growth hormone increases circulating neutrophil activation and provokes lungmicrovascular injury in septic peritonitis rats.JSurg Res,2002,105(2):195-199.

[9] Hansen TK,Fisker S,Dall R,et al.Growth hormone increase vascular cell adhesionmolecule 1 expression:in vivo and vitro evidence. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism,2004,89(2): 909-916.

Effects of recombinant human grow th hormoneon function of polymorphonuclear neutrophils in vitro

WU Xin-hai,XIWen-bing,TU Wei-feng.Department of anesthesiology,Shenzhen Hospital,Peaking University, Shenzhen518036,China

Objective To investigate the effectsof recombinant human growth hormone(rhGH)on respiratory burstand adhesion of polymorphonuclear neutrophils(PMNs)stimulated orunstimulated by lipopolysaccharide(LPS).M ethods PMNswere isolated and purified from the peripheral venous.PMNs stimulated or unstimulated by LPSwere cultured with different concentration of rhGH(10 ng/m l,100 ng/m land 1000 ng/m l)for 3 h to detect respiratory burst and adhere of PMNs.Results The lower concentration of rhGH(100 ng/ml) doesn'taffect the respiratory burstand adhesion of PMNs.The high concentration of rhGH((100 ng/ml,1000 ng/ml)enhance the respiratory burstand adhesion of PMNs.rhGH doesn'taffect the respiratory burst of PMNs stimulated by LPS.rhGH enhance the adhesion of PMNs stimulated by LPS.Conclusion rhGH in some concentration can activate the repiratory burstand adhere of PMNs,and increase adhesion of PMNs stimulated by LPS to provoke organ injury.

Human grow th hormone;Polymorphonuclear neutrophils;Respiratory burst;Adhesion

518036北京大學(xué)深圳醫(yī)院麻醉科(吳新海);廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科(郗文斌 屠偉峰)