田殿鋒，郭建昇 *，肖 虹，張艷梅

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院普外科，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科，山西太原 030001；3.山西省汾陽醫(yī)院ICU科，山西汾陽 032200

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，我國年發(fā)病率約為60/10萬，病死率約為30/10萬，居所有惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的第1位[1]。同其他實體腫瘤一樣，手術(shù)切除是尋求根治的主要手段，但僅有30%~50%的患者可獲得根治性切除，且長期預(yù)后并不滿意[2]，故近年來輔助化療已成為除手術(shù)外胃癌的另一重要治療手段。大量臨床資料表明，多西他賽（TAX）與奧沙利鉑（OXA）聯(lián)合治療多種類型的腫瘤時都有較高的療效，但在體外誘導(dǎo)人胃癌細胞凋亡的研究國內(nèi)外少有報道。本研究旨在探討多西他賽（TAX）與奧沙利鉑（OXA）聯(lián)用是否可以增強對人胃癌細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃癌SGC-7901細胞株購于武漢博士德生物工程有限公司。TAX為深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，OXA為成都長青制藥有限公司產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清購自杭州四季青公司，CCK-8試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鈣熒光探針Fluo-3/AM為美國Sigma公司產(chǎn)品，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，活細胞、凋亡細胞、壞死細胞鑒別試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃腺癌SGC-7901細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度、每隔2~3天用0.25%胰酶消化傳代一次。

1.2.2 藥物干預(yù)分組 根據(jù)公式，臨床藥物血漿峰值濃度（PPC）（mg/L）=[臨床用藥量 （mg/m2）×平均體表面積/平均體重]×100/60，結(jié)合臨床藥物常用劑量計算出每種藥物的PPC值，再參考有關(guān)文獻[3-4]，確定各實驗組每種藥物的濃度。TAX 組：2.5、5、10、20、40 mg/L，OXA 組：5、10、20、40、80 mg/L，聯(lián)合組：以相應(yīng)的TAX濃度和OXA濃度聯(lián)合應(yīng)用。

1.2.3 CCK-8法檢測不同濃度單藥及聯(lián)合用藥處理后SGC-7901細胞的生長抑制率 將處于對數(shù)生長期中的SGC-7901細胞用培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)濃度至2×104cells/ml接種于96孔板內(nèi)，100 μl/孔。待細胞貼壁后將細胞分成實驗組和對照組，對照組為不加細胞而只加培養(yǎng)基，實驗組分別加入80 μl含有不同濃度的單藥或聯(lián)合藥物，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入 CCK-8 20 μl混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定A值，所用波長450 nm，計算各復(fù)孔吸光度的平均A值，作為試驗組或?qū)φ战M的吸光度，計算細胞增殖抑制率，實驗重復(fù)3次。細胞生長抑制率=（空白對照組 A均值-實驗組 A均值）/空白對照組 A均值×100%。

1.2.4 中效濃度（Dm）及合用指數(shù)（CI）的計算 根據(jù)中效原理（Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法）[5-6]，應(yīng)用中效方程式計算來判斷兩種藥物之間相互作用的效果。中效方程式為fa/fu=（D/Dm）m，其中fa為藥物作用效應(yīng)（即抑制率），fu為存活率，fu=1-fa；D為藥物濃度，m為斜率；Dm為中效濃度IC50。根據(jù)抑制率及其濃度，繪出趨勢直線，求出直線回歸方程，計算出兩藥單用及合用時的Dm和m，然后算出兩藥的合用指數(shù)（Combination Index，CI）：CI=D1/D×1+D2/D×2+α（D1D2/D×1D×2）。 D1、D2為兩藥合用時產(chǎn)生×效應(yīng)時兩藥各自所需濃度，Dx1、Dx2為兩藥單獨使用時產(chǎn)生×效應(yīng)時兩藥各自所需濃度。當(dāng)兩藥作用機制一致時，α=1；不一致時，α=0。CI＜1兩藥合用時產(chǎn)生協(xié)同作用；CI=1 相加；CI＞1 拮抗。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)鈣濃度 取對數(shù)生長期細胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×104cells/ml加入內(nèi)置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞貼壁后，根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果選擇的劑量分別加入不同濃度的TAX、OXA，單用或合用24 h后終止培養(yǎng)，用PBS液漂洗細胞2～3次，加入終濃度為10μmol/L Fluo-3/AM應(yīng)用液，在37℃下避光孵育60 min。置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長488 nm，掃描細胞內(nèi)熒光強度，可在525 nm處探測到熒光發(fā)射，取得最大熒光信號后，采用IDQ軟件對選定的區(qū)域進行熒光強度的數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)輸入到Excel 2010作進一步分析處理。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期細胞，以5×104cells/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果選擇的劑量加入不同濃度的TAX、OXA，單用或合用經(jīng)相應(yīng)的時間作用后收集給藥組及對照組細胞，PBS 洗滌 2～3 次。 離心收集 1×105細胞，加入 500 μl Binding Buffer懸浮細胞，分別加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析細胞凋亡率。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化并計算細胞凋亡率SGC-7901細胞經(jīng)CCK-8實驗結(jié)果選擇的藥物濃度單用或合用作用24 h后，收集細胞，PBS洗細胞2次，配成濃度為5×105cells/ml的細胞懸液，取 1 μl的 Mixed Dyes Reagent與25 μl細胞懸液混勻后，吸取10 μl混勻后細胞懸液涂片，在熒光顯微鏡下觀察300個細胞，分別計數(shù)活細胞（VN）、早期凋亡細胞（VA）、晚期凋亡細胞（NVA）和死細胞（NVM）數(shù)并計算細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對SGC-7901細胞增殖的抑制作用

TAX、OXA以及兩者聯(lián)合，三組分別對胃癌SGC-7901細胞作用24 h后的細胞增殖抑制率進行比較，結(jié)果表明，各組同一時間點不同濃度對SGC-7901細胞增殖抑制率不同，隨濃度升高，增殖抑制率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TAX與OXA聯(lián)合組對細胞生長抑制率高于單藥組（P＜0.05），見表1（表中濃度分組1代表TAX組：2.5 mg/L，OXA 組：5 mg/L，聯(lián)合組：TAX 2.5 mg/L+OXA 5 mg/L；分組 2代表 TAX 組：5 mg/L，OXA 組：10mg/L，聯(lián)合組：TAX 5 mg/L+OXA 10 mg/L；其余分組以相同方式進行）。根據(jù)中效方程式計算 TAX 24 h對 SGC-7901細胞的 IC50值為 21.9 mg/L；OXA 24 h的IC50值為31.5 mg/L；聯(lián)合時 24 h的IC50值為8.74/13.68 mg/L。CI=0.42，提示兩藥有協(xié)同作用。

表1 不同處理24 h后細胞增殖抑制率（ ±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s,n=6)

表1 不同處理24 h后細胞增殖抑制率（ ±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s,n=6)

注：與 TAX 組比較，aP＜0.05；與 OXA 組比較，bP＜0.05

濃度分組 抑制率（%）TAX組 OXA組 TAX+OXA組12345 17.08±7.21 21.15±5.92 26.68±7.93 39.35±5.26 47.24±3.87 20.37±7.86a 25.25±9.27a 30.37±6.57a 41.83±4.63a 48.72±7.11a 30.65±7.24b 36.45±6.32b 45.08±5.39b 47.97±4.94b 61.52±5.27b

2.2 細胞內(nèi)Ca2+熒光強度變化

正常細胞內(nèi)外鈣離子濃度相差達100 000倍[7]。胞外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫動員形成的鈣震蕩（鈣峰或鈣波）在各種生理過程中起重要作用。病理狀態(tài)下細胞內(nèi)鈣超負荷將造成一系列代謝紊亂，直至細胞壞死或凋亡。檢測結(jié)果顯示見表2。SGC-7901細胞經(jīng)TAX和OXA單用及合用24 h后，與空白對照組相比Ca2+熒光強度明顯升高（P＜0.05）。

2.3 不同處理24 h后各組細胞凋亡率比較

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)SGC-7901細胞經(jīng)TAX和OXA單用及合用24 h，對SGC-7901細胞凋亡見表3。兩藥合用組無論與對照組或單用組相比，其誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡率的升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01）。

表2 不同處理24 h后各組細胞內(nèi)Ca2+熒光強度（ ±s）Tab.2 Ca2+fluorescence intensity of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

表2 不同處理24 h后各組細胞內(nèi)Ca2+熒光強度（ ±s）Tab.2 Ca2+fluorescence intensity of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05

空白對照組TAX組OXA組TAX+OXA組組別 藥物濃度-10 mg/L 20 mg/L 10 mg/L+20 mg/L Ca2+熒光強度18.97±2.35 312.50±25.30*387.63±26.05*562.59±19.60*

表3 不同處理24 h后各組細胞凋亡率比較（ ±s）Tab.3 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

表3 不同處理24 h后各組細胞凋亡率比較（ ±s）Tab.3 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.01

空白對照組TAX組OXA組TAX+OXA組組別 藥物濃度-10 mg/L 20 mg/L 10 mg/L+20 mg/L凋亡率（%）2.03±1.05 11.61±3.06a 13.37±2.51a 28.24±4.11a

2.4 TAX和OXA誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡

熒光顯微鏡下觀察：對照組細胞呈圓形，核質(zhì)體被均勻染成綠色，藥物作用組出現(xiàn)形狀不規(guī)則的綠色早期凋亡細胞、橙色的晚期凋亡細胞和呈橢圓形的橙黃色繼發(fā)壞死細胞，與對照組細胞相比，凋亡細胞細胞核碎裂成點狀，可見胞質(zhì)芽狀突起，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞和壞死細胞的比例逐漸增多。細胞計數(shù)后，不同處理組24 h時間點細胞凋亡率（表4），與流式細胞儀下檢測的凋亡結(jié)果基本吻合。

表4 不同處理24 h后SGC-7901細胞凋亡數(shù)（個）Tab.4 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of SGC-7901 cells after 24 h

3 討論

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面取得了一定進展，但進展期胃癌的預(yù)后仍然很差，不能手術(shù)或術(shù)后轉(zhuǎn)移的胃癌，給予化療聯(lián)合最佳支持治療與單純最佳支持治療相比，生存期和生活質(zhì)量方面均具有益處[8-9]。體外研究證明，很多抗癌藥物的抗腫瘤作用不是直接殺傷腫瘤細胞而是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡或兩種方式并存[10]，由于藥物殺傷腫瘤細胞可導(dǎo)致細胞壞死，產(chǎn)生嚴重的炎性反應(yīng)，所以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡成為治療腫瘤的理想方法。目前已經(jīng)有多種促凋亡的藥物，其中化療藥物是主要的促細胞凋亡的藥物。

多西他賽是一種新型抗腫瘤藥物，屬于紫杉類，其作用機制是促進微管蛋白聚合和阻止微管解聚，從而抑制癌細胞有絲分裂和增殖。在抑制微管解聚方面，其作用是紫杉醇的2倍，與微管蛋白有更強的親和力，血漿半衰期更長，藥物在細胞內(nèi)潴留時間更長[11]。奧沙利鉑是1，22-二氨基環(huán)己烷鉑類的水溶性衍生物，是第三代鉑類廣譜抗瘤藥，其主要作用機制是通過DNA-復(fù)合體的形成來介導(dǎo)的[12]。和第一代的鉑類藥物相比具有更強的抗瘤作用，能夠引發(fā)細胞的DNA一級和次級損傷，造成惡性腫瘤細胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同藥物濃度下，聯(lián)合用藥組對胃癌細胞抑制作用明顯強于相應(yīng)單藥組，在同一作用時間點，低濃度TAX和OXA合用，取得了與單藥高濃度組相近或更高療效，減少了單藥用量，降低高濃度化療藥帶來的較嚴重的毒副反應(yīng)。CCK-8實驗示兩藥合用指數(shù)（CI）小于1，表明兩藥間存在協(xié)同作用。通過流式細胞儀技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡檢測細胞鈣超載以及細胞的形態(tài)學(xué)觀察，證明TAX和OXA對SGC-7901細胞均具有誘導(dǎo)凋亡的作用。兩藥合用時細胞凋亡率明顯提高，可見TAX和OXA具有協(xié)同誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡的作用。

總之，本研究證實了TAX與OXA聯(lián)合用藥的合理性，為臨床設(shè)計高效低毒的胃癌化療方案提供實驗資料。

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