許忠新,李聯(lián)祥△,關(guān) 華,陳劍華

(河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院:1.人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室;2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,邯鄲 056002)

Bcl-2和Bax在去卵巢大鼠瞼板腺腺泡上皮表達(dá)的研究*

許忠新1,李聯(lián)祥1△,關(guān) 華1,陳劍華2

(河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院:1.人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室;2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,邯鄲 056002)

目的探討雌激素水平降低致瞼板腺功能障礙的發(fā)病機(jī)制。方法選用30只雌性青春期SD大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和去勢(shì)組,每組大鼠15只。分別于術(shù)前和術(shù)后24周應(yīng)用放射免疫方法檢測(cè)血清雌二醇水平;采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)瞼板腺腺泡上皮中Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果(1)去勢(shì)組術(shù)后24周血清雌二醇濃度明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);(2)去勢(shì)組瞼板腺腺泡上皮Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯低于對(duì)照組(P＜0.01),而B(niǎo)ax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論Bcl-2和Bax表達(dá)異?？赡苁谴萍に厮浇档椭虏€板腺功能障礙的因素之一。

雌激素類(lèi);瞼板腺;原癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2;bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)

瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction,MGD)是導(dǎo)致眼表淚膜異常和眼干燥癥的重要原因[1-3]。為探討性激素與眼干燥癥之間的關(guān)系,Smith等[4]調(diào)查結(jié)果表明卵巢早衰患者更傾向于出現(xiàn)眼表?yè)p害和眼干燥癥。有研究表明,通過(guò)切除大鼠卵巢可引起瞼板腺功能障礙的發(fā)生[5]。性激素水平失調(diào)致瞼板腺功能障礙的發(fā)病機(jī)制的專(zhuān)題研究較少,經(jīng)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索,唯見(jiàn)林靜等[6]有過(guò)描述,但尚欠詳盡。為完善這方面的資料,本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)30只雌性大鼠瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 56～60 d齡SD青春期大鼠30只由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量200～240 g。分為對(duì)照組(15只)

和去勢(shì)組(15只),常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 去勢(shì)動(dòng)物模型制作 大鼠術(shù)前禁水,予乙醚麻醉后固定四肢,在脊柱兩側(cè)第12肋尾側(cè)剪毛,用2%碘酊皮膚消毒,75%乙醇脫碘。沿脊柱后正中線外側(cè)1～1.5 cm處做縱形切口,依次切開(kāi)皮膚、分離肌肉、打開(kāi)壁腹膜,進(jìn)入腹膜腔,找到卵巢并切除。對(duì)照組的手術(shù)過(guò)程與去勢(shì)組相同,但不切除卵巢,只切除卵巢2周?chē)〔糠种窘M織。

1.3 血清雌二醇檢測(cè) 心臟取血2～3 mL,1 500 r/min離心15 min,-20℃保存。用放射免疫分析方法測(cè)定血清雌二醇水平(試劑購(gòu)于天津九鼎生物工程有限公司)。

1.4 組織標(biāo)本制備 大鼠處死后,立即摘除左側(cè)上眼瞼瞼板,縱行分為兩部分,置于5%甲醛液中固定,一部分用于HE染色;另一部用于免疫組織化學(xué)染色。組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋,制作成厚5～7 μ m的連續(xù)石蠟切片。

1.5 Bcl-2和Bax蛋白免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后,采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。用已知Bcl-2和Bax陽(yáng)性的正常大鼠睪丸組織標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照;用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。所用兔多克隆抗鼠Bcl-2抗體、兔多克隆抗鼠Bax抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品,免疫組織化學(xué)染色SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.6 Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù) 瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒分布即為Bcl-2和Bax陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。每例標(biāo)本選5張切片,隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400倍)的瞼板腺組織,然后計(jì)算出各組大鼠瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞Bcl-2或Bax陽(yáng)性細(xì)胞率(瞼板腺腺泡上皮Bcl-2或Bax陽(yáng)性細(xì)胞率=瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞中Bcl-2或Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞總數(shù)×100%)。為減少誤差,固定2人在多目顯微鏡下同時(shí)觀察同一切片,以核對(duì)后結(jié)果為準(zhǔn)。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,測(cè)定結(jié)果以±s表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清雌二醇水平 去勢(shì)組術(shù)后24周血清雌二醇水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),見(jiàn)表1。

表1 血清雌二醇水平( ±s,pg/mL)

表1 血清雌二醇水平( ±s,pg/mL)

*:P＜0.01,與對(duì)照組比較。

組別 手術(shù)前 手術(shù)后(24周)對(duì)照組 30.33±3.60 28.15±2.02去勢(shì)組 29.98±2.87 8.99±3.03*

2.2 Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈淡黃色、黃色或深黃色,細(xì)胞核不著色,見(jiàn)封2圖1。去勢(shì)組瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);而去勢(shì)組Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01),見(jiàn)表2。

表2 Bcl-2和 Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率( ±s,%)

表2 Bcl-2和 Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率( ±s,%)

*:P＜0.01,與對(duì)照組比較。

組別 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞率 Bax陽(yáng)性細(xì)胞率對(duì)照組 42.85±4.11 20.34±5.05去勢(shì)組 15.52±3.23* 58.46±3.07*

3 討 論

很早以前人們發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后婦女眼干燥癥的發(fā)病率明顯升高,推測(cè)眼干燥癥的發(fā)生可能與雌激素水平的降低有關(guān)[7]。為了探討性激素與瞼板腺的關(guān)系,李聯(lián)祥等[8-9]先后研究了人、大鼠等瞼板腺腺泡上皮性激素受體的表達(dá)情況,認(rèn)為雌激素及其受體的活動(dòng)與瞼板腺的分泌功能有關(guān),當(dāng)雌激素減少后,受體活動(dòng)減弱,進(jìn)而誘發(fā)眼干燥癥的發(fā)生,之后通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一推測(cè)[10-11]。

目前,細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡是研究各種類(lèi)型眼干燥癥發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)之一,無(wú)論哪種類(lèi)型的眼干燥癥,國(guó)內(nèi)外學(xué)者多注重研究淚腺、結(jié)膜組織細(xì)胞的凋亡變化,真正涉及瞼板腺組織細(xì)胞凋亡的研究報(bào)道極少。凋亡是一種主動(dòng)的、有調(diào)控的細(xì)胞死亡形式,許多基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bcl家族是研究細(xì)胞凋亡常用的一類(lèi)調(diào)控基因[12];Bcl-2和Bax是其家族中重要的2種基因蛋白。Bcl-2蛋白位于細(xì)胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜上[13],是細(xì)胞凋亡抑制基因的典型代表,其通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放,最終發(fā)揮抑制凋亡的作用。Bax蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,其主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),但當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí),它從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移到線粒體,并與線粒體膜相結(jié)合,然后轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi),可引起線粒體釋放大量的蛋白質(zhì),包括細(xì)胞色素C等蛋白分子的釋放,誘導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活,引起細(xì)胞的凋亡[14]。瞼板腺分泌的脂質(zhì)具有潤(rùn)滑角膜及結(jié)膜、減少淚膜水分的蒸發(fā)、參與屈光作用、防止眼干燥癥發(fā)生作用。本研究結(jié)果顯示對(duì)照組瞼板腺腺泡上皮Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯大于Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率,這樣有利于抑制細(xì)胞凋亡,在維持正常瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞的分化、增殖速率,確保瞼板腺正常組織形態(tài)的構(gòu)建和分泌功能、維持正常眼表結(jié)構(gòu)的健康方面具有重要意義。相反,在去勢(shì)組瞼板腺腺泡上皮Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯大于Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率,表明卵巢切除后,在雌激素水平降低的狀態(tài)下,瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞凋亡加速,干擾和破壞了瞼板腺組織細(xì)胞正常分化速率,最終導(dǎo)致具有分泌功能的腺上皮細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少,分泌脂質(zhì)相對(duì)缺乏。因此,瞼板腺腺泡上皮Bcl-2和Bax異常表達(dá)是雌激素水平降低致瞼板腺功能障礙的機(jī)制之一。至于雌激素水平降低通過(guò)哪種信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘發(fā)Bcl-2和Bax異常表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

Bcl-2和Bax自身或彼此之間具有形成二聚體的能力,二者之間的比例決定著細(xì)胞的生存還是凋亡[15]。有實(shí)驗(yàn)表明Bcl-2/Bcl-2和Bax/Bcl-2二聚體具有抑制凋亡的作用,而B(niǎo)ax/Bax二聚體具有促進(jìn)凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示去勢(shì)后在雌激素水平降低狀態(tài)下,瞼板腺腺泡上皮細(xì)胞的Bax/Bax二聚體更容易形成,使細(xì)胞處于促進(jìn)凋亡狀態(tài)。

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Expression of Bcl-2 and Bax in the meibomian gland acinar epithelial cell at ovariectomized rats*

XuZhongxin1,Li Lianxiang1△,Guan Hua1,Chen J ianhua2
(1.Departmentof Anatomy and Tissue Embryology;2.Laboratory of Medicine,Medical College of Hebei Engineering University,Handan 056002,China)

ObjectiveTo explore the mechanism of meibomian gland dysfunction caused by low estradiol at ovariectomied rats.Methods30 SD female adolescent rats were divided into control group and the ovariectomized group randomly(15 rats in each group).Serum estradiol levels of two groups rats were measured by radioimmunoassay at pre-operation and 24 weeks after operation.The meibomian gland were observed using immunohistochemistry methods.Results(1)The estradiol level of the castrated group was significantly decreased compared with that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01).Bcl-2 positive cells of the castrated group was significantly lower than that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01);Bax positive cells of the castrated group was significantly higher than that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01).ConclusionAbnormal expression of Bcl-2 and Bax may be one of the mechanisms of the meibomian gland dysfunction with low level estradiol at ovariectomied rats.

estrogens;meibomian glands;proto-oncogene proteins c-bcl-2;bcl-2-associated X protein

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.002

A

1671-8348(2011)05-0420-02

河北省邯鄲市科技局資助項(xiàng)目(072917061-4)?！? class="emphasis_bold">通訊作者,

,Tel:(0310)3115836;E-mail:jpx kn@126.com。

2010-03-08

2010-08-22)

·論 著·