鄭定容 劉 仿

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬西鄉(xiāng)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518102；2.東莞市廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理處，廣東東莞 523808）

甲胎蛋白（AFP）主要在胎兒肝中合成，分子量6.9萬(wàn)，在胎兒13周AFP占血漿蛋白總量的1/3[1]。在妊娠30周達(dá)最高峰，以后逐漸下降，出生時(shí)血漿中濃度為高峰期的1%左右，約40mg/L，在周歲時(shí)接近成人水平（低于30μmg/L）。但當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，AFP基因表達(dá)重新開(kāi)放，于血清中可檢測(cè)到AFP 濃度顯著升高[2]。目前，定量檢測(cè)血清AFP的方法很多，主要有化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫法，本研究分別應(yīng)用對(duì)比試驗(yàn)、回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

樣本取自2006年4月～2009年12月深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院住院或門(mén)診原發(fā)性肝癌患者，隨機(jī)抽檢30例，年齡21～80歲，平均（55.0±5.3）歲。所有病例根據(jù)臨床表現(xiàn)，經(jīng)B超、CT、MRI及各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢查確診，部分病例經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甲胎蛋白診斷試劑盒（鄭州市博賽生物技術(shù)股份有限公司）；AFP定值質(zhì)控品（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，批號(hào)：33219））：7.00ng/mL、80.00ng/mL、1725.00ng/mL；AFP定值標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）0.00ng/mL、2.50ng/mL、5.00ng/mL、25.00ng/mL、100.00ng/mL、500.00ng/mL、3000.00ng/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ACCESS全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）、EPPENDDORF 5415 D高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)EPPENDDORF公司）、RA-22100C Milcrop late Reader酶標(biāo)儀、RA-2600CMilcrop lateWasher洗板機(jī)（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 對(duì)比實(shí)驗(yàn) 將隨機(jī)抽檢的30份患者標(biāo)本分別用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。設(shè)y為ICA 法所測(cè)AFP含量，x為ELISA所測(cè)AFP含量，最后進(jìn)行回歸方程。

1.4.2 回收試驗(yàn) 取不同濃度的混合血清，AFP 濃度為10.71 ng/mL、18.08 ng/mL、46.83 ng/mL，分別加入不同濃度定值血清，用ICA法和ELISA法分別檢測(cè)其回收率。

1.4.3 精密度試驗(yàn)比較 取混合血清（AFP含量為56.00 ng/mL），分別用兩種方法同時(shí)平行20次測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)誤差；連續(xù)10d，2次/d，計(jì)算批間誤差。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包。

2 結(jié)果

ICA 法的批內(nèi)、批間精密度均優(yōu)于ELISA法，ICA法在檢測(cè)準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性上，較之ELISA具有很強(qiáng)的優(yōu)越性。見(jiàn)表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)（%）

將隨機(jī)抽檢的30份患者標(biāo)本分別用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。設(shè)y為ICA 法所測(cè)AFP含量，x為ELISA所測(cè)AFP含量，則回歸方程： y=1.54x＋9.09，相關(guān)系數(shù)r=0.982。該結(jié)果顯示，ELISA測(cè)得的AFP含量與ICA法測(cè)的AFP含量存在回歸關(guān)系，x和y正相關(guān)，且相關(guān)性較好。

取不同濃度的混合血清，AFP 濃度為10.71ng/mL、18.08ng/mL、46.83 ng/mL，分別加入不同濃度定值血清，用ICA法和ELISA法分別檢測(cè)其回收率。用ICA和ELSIA測(cè)得的回收率分別在96.84%～98.85%和93.90%～98.16%，平均回收率分別為98.04%和96.42%，ICA的檢測(cè)精度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，回收率高于ELISA。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 ELSIA在AFP腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)中的應(yīng)用

甲胎蛋白是1956 年由Bergstrandh和Czar在人胎兒血清中發(fā)現(xiàn)的一種甲種球蛋白，它被認(rèn)為是輔助診斷肝癌最好的臨床檢測(cè)方法[3]。ELISA以快速、簡(jiǎn)便實(shí)效的優(yōu)勢(shì)在基層廣泛應(yīng)用。雖然ICA法的線性范圍、精密度等方面明顯優(yōu)于ELISA法，但是在人體正常值參考范圍內(nèi)的AFP檢測(cè)，ELISA法具有快速、簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，在健康體檢人群普查，良性肝病患者定期檢查中起到很好篩查作用。由于ELISA反應(yīng)中難以避免的“鉤狀效應(yīng)”[4]，即測(cè)定顯色隨著待測(cè)標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測(cè)定吸光度隨抗原濃度的增加而開(kāi)始下降至不顯色，容易造成假陰性結(jié)果，AFP高值反而測(cè)為低值，樣本需稀釋才能準(zhǔn)確測(cè)定。同時(shí)，ELISA反應(yīng)存在手工操作誤差，重線性不及ICA法。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)(n=20)

3.2 ICA在AFP腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)中的應(yīng)用

ICA采用經(jīng)典的免疫學(xué)原理，具有高度特異性，不受黃疸、脂血、溶血等因素影響。自動(dòng)化程度高，減少了人為操作誤差；方法靈敏度高可獲得很低的檢測(cè)下限值；穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線2～4周校正一次，患者可隨到隨做且無(wú)放射性污染。

ACCESS型全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)以磁性微粒子為載體[5]，最大限度擴(kuò)大包被面積，以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原、抗體，采用最靈敏的發(fā)光底物AMPPD磁性微粒子包被技術(shù)的應(yīng)用大大提高檢測(cè)的靈敏度，使化學(xué)發(fā)光法的線性范圍更寬；光電倍增管接受發(fā)光強(qiáng)度信號(hào)（發(fā)光穩(wěn)定后，記錄11次/s，取9次均值為結(jié)果）；超聲波清潔系統(tǒng)，防止交叉污染 （＜1PPM），使得檢測(cè)結(jié)果更為穩(wěn)定可靠。彌補(bǔ)了ELISA法批間誤差大、結(jié)果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。徹底解決了放射免疫檢測(cè)的污染問(wèn)題以及方法繁瑣。

ICA 為化學(xué)發(fā)光法類(lèi)型之一，將發(fā)光技術(shù)與免疫反應(yīng)和計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合。ICA 法與其它標(biāo)記免疫分析相比，具有檢測(cè)靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確性高、無(wú)放射性污染、檢測(cè)線性范圍寬、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前成為免疫檢測(cè)廣泛采用的新技術(shù)之一[6]。具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量范圍寬、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便等許多優(yōu)點(diǎn)，在臨床和科研中得到了日益廣泛的應(yīng)用。

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[2] Acevedo H F.Human chorionic gonadotrop in （ HCG），the hormone of life and death： a review[J].Journal of Experimental Therapeutic and Oncology，2002，2（3）：133-145.

[3] Goldstein MJ，Mitchell EP.Carcinoembryonic antigen in the staging and follow up of patientswith colorectal cancer[J].Cancer Invest，2005，23：338-351.

[4] 魏東，鄧愛(ài)文，牟成惠. ICA，RIA和ELISA法測(cè)定甲胎蛋白的比較[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21（6）：459-460.

[5] 凌慶枝，周昕，張紀(jì)原.磁性分離酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)人類(lèi)絨毛膜促性腺激素及其臨床意義分析[J].生物學(xué)雜志，2000，17（3）：32.

[6] 羅俊敏，朱劍峰，宋小龍.動(dòng)態(tài)檢測(cè)HCG濃度對(duì)滋養(yǎng)葉細(xì)胞疾病的臨床判斷[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志，2002，2（9）：1317-1318.