王慧，曹穎瑛，李燕，譚光國(guó)，朱臻宇

1. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433； 2. 北京中國(guó)人民解放軍總后勤部鄭常莊干部休養(yǎng)所，北京 100141

白假絲酵母是一種人類常見(jiàn)條件致病真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，在人體抵抗力下降時(shí)會(huì)引起感染甚至危及生命。近年來(lái)，深部真菌感染日益成為醫(yī)院內(nèi)主要感染，其中白假絲酵母成為假絲酵母感染中最常見(jiàn)的病原[1]。

白假絲酵母是一種具有多種形態(tài)的真菌，形態(tài)有厚膜孢子、酵母、假菌絲、菌絲等。其中菌絲相與酵母相的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是影響致病的重要因素。已有許多研究證實(shí)，不產(chǎn)生菌絲相的基因缺陷型白假絲酵母在動(dòng)物模型中致病性降低，而酵母相的白假絲酵母則有助于播散性感染[2]。生物被膜是由酵母細(xì)胞、菌絲和細(xì)胞外多聚基質(zhì)3部分組成的一種結(jié)構(gòu)群體[1]。在白假絲酵母中，生物被膜的形成會(huì)使其對(duì)一些臨床常用抗真菌感染藥物產(chǎn)生高度耐藥性。因此，白假絲酵母的形態(tài)變化對(duì)其在宿主環(huán)境下的生存、致病及耐藥性有很大意義。在白假絲酵母形態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，能自發(fā)向細(xì)胞外釋放一些特定信號(hào)分子，調(diào)節(jié)微生物的密度變化，這類小分子物質(zhì)稱為群體感應(yīng)分子(quorum sensing molecule)。目前白假絲酵母中已確定的群體感應(yīng)分子有法尼醇(farnesol)、酪醇(tyrosol)和麝油酸(farnesoic acid)[3]。此外，不同形態(tài)的白假絲酵母對(duì)氨基酸的攝取不完全相同，甚至存在很大差異[4]。

在宿主中生存時(shí)，受大量外界環(huán)境的影響，如宿主的免疫系統(tǒng)、滲透性、溫度、pH值、氧化水平、養(yǎng)分有效性、氧化還原態(tài)等，白假絲酵母會(huì)發(fā)生很大變化，承受極大的外界壓力。處于逆境中的白假絲酵母會(huì)于數(shù)分鐘內(nèi)在基因和代謝水平上作出適當(dāng)反應(yīng)，最終使細(xì)胞獲得對(duì)逆境的抗性[5]。這些對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)激性使白假絲酵母快速適應(yīng)外界環(huán)境，對(duì)其耐藥性的產(chǎn)生起一定作用。當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白假絲酵母面臨高溫、NaCl、H2O2、CuSO4、高濃度乙醇、弱有機(jī)酸(山梨酸酯和苯甲酸)等脅迫時(shí)，會(huì)不同程度引起細(xì)胞內(nèi)海藻糖(trehalose)濃度上升[5-7]；受高滲和檸檬酸影響時(shí)會(huì)積累大量甘油(glycerol)；受高溫和氧化應(yīng)激時(shí)會(huì)生成大量阿拉伯糖醇(D-arabitol)[8]，這些化合物都對(duì)白假絲酵母的生物大分子有一定的保護(hù)作用。

1 胞外活性代謝物

白假絲酵母在生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)化合物，分泌至胞外，其中部分為群體感應(yīng)分子。對(duì)這類化合物的提取和分離主要是收集培養(yǎng)上清液，再對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行一系列處理，然后供分析。

1.1 法尼醇

法尼醇是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的白假絲酵母生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的胞外群體感應(yīng)分子[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，它能影響白假絲酵母的雙相性和被膜生長(zhǎng)，抑制芽管形成[10]，抑制酵母向菌絲轉(zhuǎn)化[11]，抑制被膜形成；同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)由H2O2等引起的氧化性應(yīng)激下白假絲酵母的存活率[12]，是目前發(fā)現(xiàn)的白假絲酵母中作用最強(qiáng)、研究最多的群體感應(yīng)分子。

法尼醇是揮發(fā)性的萜類化合物，因此常用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)進(jìn)行檢測(cè)。 Hornby等[10]將收集的含法尼醇的培養(yǎng)上清液進(jìn)行過(guò)濾后直接進(jìn)樣，或采用乙酸乙酯液-液萃取，進(jìn)一步提純其中脂溶性有效成分，并分別采用反相高效液相色譜-質(zhì)譜(reversed-phase high performance liquid chromatography-mass spectrometry，RP-HPLC-MS)、衍生化GC-MS、薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)對(duì)法尼醇進(jìn)行鑒定。而Ghosh等[13]也是將培養(yǎng)上清液過(guò)濾后，用液-液萃取(乙酸乙酯)結(jié)合GC-MS方法來(lái)分離、檢測(cè)法尼醇。與Hornby等不同的是，樣品并未進(jìn)行衍生化處理，若采用己烷或乙酸乙酯/己烷(1∶4)萃取上清液，只適用于提取法尼醇；而用乙酸乙酯萃取，可同時(shí)提取白假絲酵母中苯乙醇(phenylethyl alcohol)、法尼醇、色醇(tryptophol)和酪醇4種小分子。Martins 等[14]采用頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)/GC-MS同時(shí)測(cè)定浮游和被膜型白假絲酵母中異戊醇、2-苯乙醇、1-十二醇、橙花叔醇和法尼醇等醇類化合物。Gregus等[15]采用乙腈沉淀蛋白的方法處理樣品后，用超高效液相色譜-質(zhì)譜 (ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS)測(cè)定尼醇和酪醇。

1.2 麝油酸

Oh等[16]最早分離出麝油酸，并發(fā)現(xiàn)其能抑制酵母向菌絲轉(zhuǎn)化。與法尼醇相比，麝油酸的分泌有局限性，僅能在特定菌株中表達(dá)，且作用相對(duì)較弱，僅為法尼醇的3%[3]。高濃度麝油酸可抑制白假絲酵母菌絲生長(zhǎng)，但不抑制酵母生長(zhǎng)[16,17]。相對(duì)法尼醇，麝油酸對(duì)酵母向菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化的選擇性更強(qiáng)[18]。

Oh等[16]將培養(yǎng)上清液凍干，用甲醇復(fù)溶，離心后取上清液；再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇溶液揮干，用己烷復(fù)溶；正相高效液相色譜(normal-phase high performance liquid chromatography，NP-HPLC)進(jìn)行分離，收集流出的有效成分；揮干，用0.1 ml的90%乙腈復(fù)溶，RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫，獲得麝油酸單體；并用GC-MS和核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3 酪醇

Chen等[19]指出，酪醇的分泌會(huì)促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，從而縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間。在利于菌絲生長(zhǎng)的條件下，酪醇還會(huì)縮短細(xì)胞發(fā)展成芽管的時(shí)間，促進(jìn)芽管形成，該作用在被膜生長(zhǎng)的早期和中期最為顯著[20]。

Chen等[19]固相萃取、富集白假絲酵母培養(yǎng)液后，用RP-HPLC純化、制備酪醇，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行NMR鑒定。Alem等[20]改良了上述方法，縮短了酪醇的出峰時(shí)間。Ghosh等[13]采用乙酸乙酯液-液萃取結(jié)合GC-MS的方法分離、鑒定酪醇，該法同樣可用于測(cè)定白假絲酵母中苯乙醇、法尼醇、色醇等其他小分子。魏昕等[21]將生物被膜培養(yǎng)上清液離心、抽濾后，采用HPLC檢測(cè)酪醇。Gregus等[15]將收集的液體用乙腈沉淀蛋白后，采用UPLC-MS測(cè)定酪醇，同時(shí)測(cè)定了法尼醇和酪醇。

1.4 苯乙醇和色醇

有報(bào)道，苯乙醇和色醇在白假絲酵母中起抑制菌絲形成和細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但這2個(gè)化合物對(duì)白假絲酵母形態(tài)的影響機(jī)制尚不明確[3,22]，但要達(dá)到500 μmol/L才能抑制絲化現(xiàn)象[22]，所以其在正常濃度范圍內(nèi)抑制菌絲的作用有待進(jìn)一步研究。此外，研究還發(fā)現(xiàn)色醇具有細(xì)胞毒性[22]。Lingappa等[22]用氯仿萃取培養(yǎng)上清液，用MS鑒定這2種化合物。Hazen等[23]采用將上清液過(guò)濾后以GC方法測(cè)定苯乙醇和色醇。Kosalec等[24]采用液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)鑒別和定量色醇。Martins等[14]采用HS-SPME/GC-MS對(duì)苯乙醇等醇類進(jìn)行分析。Ghosh等[13]采用乙酸乙酯液-液萃取方法分離、提純苯乙醇和色醇，并將濃縮液用GC-MS進(jìn)行分析。

1.5 MARS

Hazen和Cutler[25]在白假絲酵母研究中發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)并命名為MARS，它能耐高溫，70 ℃下放置30 min還能保持穩(wěn)定，但在分離48 h后或pH超出4～9.5時(shí)，就會(huì)失去抑制絲化的活性。不僅白假絲酵母可分泌MARS，熱帶假絲酵母也可分泌。Hazen 和 Cutler將含MARS的組分用吡啶或乙醚萃取后，經(jīng)RP-HPLC進(jìn)一步純化、收集。經(jīng)鑒定，MARS有1個(gè)含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，能抑制假絲酵母中氨基酸攝取。但MARS分子結(jié)構(gòu)及其在調(diào)節(jié)白假絲酵母形態(tài)轉(zhuǎn)化中的作用仍需深入研究。

2 胞內(nèi)代謝物

白假絲酵母代謝產(chǎn)生用于合成蛋白質(zhì)、核酸、類脂和多糖等的一些小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸和單糖衍生物等，與微生物細(xì)胞內(nèi)生物合成息息相關(guān)。要對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行分析，首先要進(jìn)行細(xì)胞破碎，目前主要方法有[26,27]化學(xué)試劑裂解、低滲溶液脹破、反復(fù)凍融和機(jī)械性方法，將細(xì)胞破碎后才能對(duì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行下一步研究。

2.1 氨基酸類

氨基酸對(duì)白假絲酵母形態(tài)轉(zhuǎn)化起一定作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，血清和氨基酸都是已知的能誘導(dǎo)白假絲酵母發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，但其分子機(jī)制仍不明確[28]。氨基酸種類或數(shù)量不足也會(huì)刺激白假絲酵母的形態(tài)變化。白假絲酵母的2種形態(tài)對(duì)各種氨基酸的攝取需求也不完全相同，甚至存在很大差異[4,29,30]。

早期，對(duì)白假絲酵母中氨基酸的分析方法主要是往培養(yǎng)基中加入放射性核素標(biāo)記的氨基酸(如L-3H-氨基酸)，待菌體收集、洗滌完全后，吹干，轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中，用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)[6]。近年來(lái)，色譜技術(shù)廣泛運(yùn)用于氨基酸的分析。Flynn等[31]采用柱前衍生化RP-HPLC對(duì)氨基酸進(jìn)行測(cè)定。

2.2 海藻糖

海藻糖是化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的非還原性二糖，由2個(gè)吡喃葡萄糖分子通過(guò)α-1，1-糖苷鍵連接而成[6]。它是細(xì)胞中的一種應(yīng)激代謝物，當(dāng)細(xì)胞處于長(zhǎng)時(shí)間饑餓、高滲、熱激以及孢子萌發(fā)時(shí)，海藻糖含量會(huì)發(fā)生顯著變化，恢復(fù)正常環(huán)境后又迅速降解。因此，海藻糖含量的變化從某種程度上反映了機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)，在對(duì)不同脅迫應(yīng)答中，海藻糖的積累被認(rèn)為起關(guān)鍵作用[5,7]。

Pfyffer等[32]采用熱乙醇將細(xì)胞破碎后，過(guò)濾取上清液，再經(jīng)三甲基硅烷衍生化后進(jìn)行GC分析，該法可同時(shí)測(cè)定甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇和海藻糖。Cao等[33]和Lu等[34]將細(xì)胞以微波破碎后，收集上清液，用HPLC-MS分析海藻糖。Askew等[35]則用熱水萃取胞內(nèi)代謝物，取上清液后用酶法分析海藻糖和甘油。

2.3 甘油和阿拉伯糖醇

白假絲酵母在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)積累大量甘油和D-阿拉伯糖醇，造成哺乳動(dòng)物感染。在培養(yǎng)6 h后能產(chǎn)生最大量的甘油，在12 h產(chǎn)生最大量的D-阿拉伯糖醇和核糖醇。這些多元醇的釋放與胞外環(huán)境有關(guān)[36]。

1981年Bernard等[36]將細(xì)胞處理后，用三甲基硅醚衍生化，以α-甲基甘露苷作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)GC定量測(cè)定D-阿拉伯糖醇。Pfyffer等[32]采用熱乙醇將細(xì)胞破碎，過(guò)濾取上清液，有效成分經(jīng)三甲基硅烷衍生化后進(jìn)行GC分析。該法可同時(shí)測(cè)定甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇和海藻糖，但未能將核糖醇和阿拉伯糖醇分開(kāi)，且甘油出峰時(shí)間較靠前，可能被衍生化試劑的峰掩蓋。Kayingo和 Wong[8]以α-甲基甘露苷和α-甲基葡萄糖苷作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)GC分析同時(shí)測(cè)定D-阿拉伯糖醇、核糖醇、甘露醇和山梨醇(半乳糖醇)，其中將D-阿拉伯糖醇和核糖醇(同分異構(gòu)體)分離；但該法未能檢測(cè)甘油，作者進(jìn)一步將樣品酶解后采用紫外吸光度法對(duì)甘油進(jìn)行定量。Wesolowski等[37]和Askew等[35]也采用酶法分析胞內(nèi)甘油。而Kayingo等[38]則采用放射性核素標(biāo)記甘油(14C-甘油)，收集菌體后，轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中，用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

3 結(jié)語(yǔ)

白假絲酵母的胞內(nèi)、外活性代謝物種類繁多(表1)，功能非常復(fù)雜。作為生物體基因表達(dá)的終產(chǎn)物，活性代謝物的變化反映了細(xì)胞對(duì)基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)。通過(guò)對(duì)活性代謝物種類和含量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)合已有的代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行研究，將為深入探索白假絲酵母自身代謝調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的思路。

表1白假絲酵母相關(guān)代謝物

Tab.1RelatedmetabolitesofCandidaalbicans

CompoundStructureMARSUnknown, containing an amine ringFarnesolTyrosol Farnesoic acidPhenylethyl alcoholTryptopholAmino acidGlycerolD-arabitolTrehalose

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