王俊杰，馬玉濤，惠榮奎，劉天雄，劉 焰

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究所，湖北武漢430070)

麥藍(lán)菜〔Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke〕為石竹科麥藍(lán)菜屬一年生或二年生草本植物［1］，在我國分布廣泛、資源豐富，除華南外，全國各地均有分布［2］。麥藍(lán)菜的成熟干燥種子稱王不留行又名麥藍(lán)子等，為傳統(tǒng)常用中藥。其主要成分是止血、治療婦科疾病及抗腫瘤的良藥［3］。近年來有關(guān)王不留行的藥用成分及藥理作用的報(bào)道很多，但有關(guān)其細(xì)胞學(xué)研究的報(bào)道相對較少，楊德奎等(1994)［4］報(bào)道了山東濟(jì)南麥藍(lán)菜的染色體數(shù)目和核型，陳瑞陽(2009)［5］報(bào)道了河北安國麥藍(lán)菜的染色體數(shù)目和核型。染色體核型分析是進(jìn)行植物種質(zhì)資源收集及鑒定的基礎(chǔ)性工作，因而本研究通過對河南禹州麥藍(lán)菜的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的染色體行為、花粉粒育性進(jìn)行觀察以及對其體細(xì)胞染色體進(jìn)行核型分析，旨在為麥藍(lán)菜的良種選育、真?zhèn)纹疯b定和種質(zhì)資源多樣性研究及分類提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料2006年從河南省禹州引種，現(xiàn)種植于武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究所標(biāo)本園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 減數(shù)分裂觀察方法

取麥藍(lán)菜的幼小花蕾，在4℃下用卡諾固定液固定24 h，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，?mol/L鹽酸60℃恒溫解離2～3 min后，用改良卡寶品紅染色壓片，在顯微鏡下觀察并攝影。

1.2.2 花粉粒育性鑒定方法

取成熟的麥藍(lán)菜花粉粒于載玻片上，用1%醋酸洋紅染色1 min后，在光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并照相。染色深、外形圓的計(jì)為可育花粉粒，不染色或染色淺的、外形皺癟的計(jì)為敗育花粉粒。一朵花至少統(tǒng)計(jì)300個(gè)花粉粒，計(jì)算可育花粉粒百分率。

1.2.3 體細(xì)胞觀察方法

將種子置于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待根生長到0.5 ～1.0 cm 時(shí)，切取根尖置于0.002 mol/L 8－羥基喹啉中，在室溫下預(yù)處理4 h后，用卡諾氏固定液4℃下固定24 h，制片時(shí)用l mol/L鹽酸60℃恒溫解離9～11 min，切取根尖分生組織，用卡寶品紅染色壓片，在顯微鏡下觀察攝影。

1.2.4 核型分析方法

取50個(gè)分散良好，著絲點(diǎn)清晰的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，并從中選擇染色體數(shù)目完整、無重疊的5個(gè)分散較好的分裂相進(jìn)行顯微攝影。染色體相對長度、臂比及類型型按Levan(1964)［6］命名系統(tǒng)，染色體相對長度系數(shù)按Kuo(1972)［7］方法劃分，核型分類用 Stebbins(1971)［8］的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 麥藍(lán)菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程觀察

麥藍(lán)菜的絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體的行為正常。在粗線期，染色體明顯變粗，每條染色體上出現(xiàn)數(shù)目、大小不等，位置不同的染色深的染色粒(圖1－a)。終變期同源染色體配對后，可形成15個(gè)高度濃縮、形態(tài)較為清晰的二價(jià)體(圖1－b)，佐證了麥藍(lán)菜的染色體數(shù)目為2n=2X=30，該時(shí)期是染色體計(jì)數(shù)的最佳時(shí)期。在中期I，二價(jià)體聚集并排列到赤道面上形成赤道板(圖1－c)，此期觀察到少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)落后染色體現(xiàn)象(圖1－d)。后期I，配對的同源染色體彼此分離，在紡錘絲的牽引下，分別向細(xì)胞的兩極移動(dòng)(圖1－e)，此期觀察到少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)染色體橋現(xiàn)象(圖1－f)。在末期I，染色體并沒有出現(xiàn)明顯的解聚現(xiàn)象，在細(xì)胞2極分別形成兩個(gè)新的子核，但細(xì)胞質(zhì)不分裂。前期II，染色體分散到細(xì)胞質(zhì)中，每個(gè)子細(xì)胞中具有15個(gè)單價(jià)染色體(圖1－h(huán))。中期II，2個(gè)子細(xì)胞中的染色體都排列到細(xì)胞的赤道面上，分別形成2個(gè)呈一定角度的赤道板(圖1－h(huán))，此期也觀察到少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)染色體落后的情況(圖1－i)。后期II，每條染色體上的2個(gè)姐妹染色單體分開，分別走向細(xì)胞兩極，此時(shí)在細(xì)胞內(nèi)可看到4組染色體(圖1－j)。末期Ⅱ細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)4個(gè)子核，接著細(xì)胞質(zhì)分裂并形成4個(gè)子細(xì)胞，即為四分體(圖1－l)，另外，此期有少數(shù)三分體形成;其減數(shù)分裂方式屬于同時(shí)型，在減數(shù)分裂過程中僅有15.8%的花粉母細(xì)胞出現(xiàn)染色體落后、橋等異?，F(xiàn)象。

2.2 花粉粒育性觀察結(jié)果

通過隨機(jī)取樣的方法，共觀察統(tǒng)計(jì)了1 212個(gè)成熟花粉粒的醋酸洋紅染色反應(yīng)結(jié)果，其中不被染色或染色淺的、外形皺癟的的花粉粒僅145個(gè)，可育花粉粒為88.04%，花粉敗育率為11.96%。

2.3 體細(xì)胞核型分析結(jié)果

通過對50個(gè)麥藍(lán)菜根尖細(xì)胞中期染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，確定其染色體數(shù)目為2n=30，同時(shí)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期形成15個(gè)二價(jià)體，未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目變異，可以確定麥藍(lán)菜為二倍體。核型分析參數(shù)取自5個(gè)分散良好，著絲點(diǎn)清晰的中期細(xì)胞染色體的平均值，核型分析內(nèi)容見表1，同源染色體配對后的核型圖見圖3，核型模式圖見圖4。結(jié)果表明:麥藍(lán)菜最長染色體和最短染色體之比為1.52，無臂比大于2∶1的染色體，核型不對稱系數(shù)為60.02%，核型公式為 K(2n)=2X=30=22m(2SAT)+8sm，其中第14號(hào)染色體具有隨體，相對長度組成為2n=16M2+14M1，麥藍(lán)菜的核型為“1A”對稱型核型。

表1 麥藍(lán)菜染色體的相對長度、臂比及類型

3 討論

本研究結(jié)果表明，河南禹州麥藍(lán)菜的染色體數(shù)目為2n=2x=30，其核型為“1A”型，與楊德奎等［4］報(bào)道的濟(jì)南千佛山麥藍(lán)菜的染色體數(shù)目及核型雖然相同，但核型公式存在較大差異，本研究結(jié)果的核型公式為K(2n)=2x=30=22m(2SAT)+8sm，表明在河南禹州麥藍(lán)菜的染色體組中包括11對中著絲粒染色體和4對近中著絲粒染色體，且隨體位于第14號(hào)染色體上;而楊德奎等報(bào)道的麥藍(lán)菜核型公式為K(2n)=30=2M+26m+2sm，即濟(jì)南千佛山麥藍(lán)菜的染色體組中包括1對正中著絲粒染色體、13對中著絲粒染色體和1對近中著絲粒染色體，未見隨體染色體;陳瑞陽等［5］報(bào)道麥藍(lán)菜的核型為“2A”型，核型公式為K(2n)=30=16m(2SAT)+12sm+2st，即河北安國麥藍(lán)菜的染色體組中包括8對中著絲粒染色體、6對近中著絲粒染色體及1對近端著絲粒染色體，且隨體位于第6號(hào)染色體上，與本研究和楊德奎等報(bào)道的結(jié)果差異較大;上述差異表明不同來源、不同種質(zhì)的麥藍(lán)菜在染色體水平上存在差異，即存在遺傳多樣性。Stebbins［8］認(rèn)為植物界核型進(jìn)化的趨勢是從對稱到不對稱，因此，麥藍(lán)菜的進(jìn)化地位屬于較原始類型。

本研究結(jié)果還表明，麥藍(lán)菜絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體的行為正常，僅在少數(shù)花粉母細(xì)胞中觀察到染色體落后、染色體橋等異?，F(xiàn)象，花粉粒育性為88.04%。李雪等［9］通過對蘭州百合小孢子母細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)斷片、落后染色體和染色體橋等減數(shù)分裂異常是導(dǎo)致敗育花粉產(chǎn)生的主要因素。王恒昌等［10］根據(jù)秤錘樹減數(shù)分裂異常出現(xiàn)的比例與花粉粒敗育性比例比較一致，得出秤錘樹的小孢子在發(fā)生和發(fā)育過程中較高頻率的敗育現(xiàn)象可能存在一定的細(xì)胞學(xué)原因。另外，程志號(hào)等［11］在黃芩、馬玉濤等［12］在益母草及杜玉娟等［13］在半枝蓮的研究中，均認(rèn)為花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體行為的異常導(dǎo)致了子細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的不均衡分配，致使產(chǎn)生不育花粉。在進(jìn)化上穩(wěn)定的植物通過花粉敗育淘汰染色體數(shù)目變異的配子，有利于維持物種的穩(wěn)定性［14］。因此，麥藍(lán)菜少數(shù)花粉細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)染色體落后、染色體橋等異?，F(xiàn)象可能是導(dǎo)致11.96%花粉敗育的主要原因。

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