林芳花，彭永宏，江 順，廖建良，葉海宇

(1.惠州學院生命科學系/生物技術(shù)研究所，廣東惠州516007;2.惠州龍發(fā)山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，廣東惠州516001)

沉香為珍貴瀕危的中藥材，為瑞香科植物沉香(Aquilaria agallocha Roxb.)或白木香〔Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.〕含黑色樹脂的木質(zhì)部，前者主產(chǎn)于印度和馬來西亞等國，稱為進口沉香，后者主產(chǎn)于我國海南、廣東、廣西等省區(qū)，為國產(chǎn)沉香［1］，具有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘等功效，用于胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等［2］。由于沉香僅以有黑色樹脂的木質(zhì)部入藥，其它部分如葉、根等資源沒有得到有效的利用。研究者發(fā)現(xiàn)沉香葉具有抗炎、鎮(zhèn)痛、便秘、腸梗阻、肥胖、出血及腦缺血、降血糖、抗腫瘤等作用［3］，沉香葉產(chǎn)量大，開發(fā)前景廣闊。因此，對沉香葉進行提取工藝研究，獲得經(jīng)濟實用的提取工藝，并評價其抗氧化活性，可以為綜合開發(fā)利用沉香葉資源提供參考。

1 材料

1.1 藥材及藥品

野生沉香葉和栽培沉香葉于2010年2月分別采自廣東省惠州市秋長鎮(zhèn)和廣東省惠州龍發(fā)山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司秋長鎮(zhèn)沉香種植基地，原植物經(jīng)惠州學院生命科學系廖建良教授鑒定為瑞香科植物白木香〔Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.〕。采收后于烘箱中50℃干燥，粉碎成粗粉，備用。維生素C:天津市大茂化學試劑廠，批號20100223，分析純。

1.2 試 劑

無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氮藍四唑(NBT)、核黃素、蛋氨酸、三氯乙酸、氯化鐵、鐵氰化鉀、高錳酸鉀、濃硫酸等均為分析純。

1.3 器 材

FA1104A電子天平(上海精天電子儀器有限公司，精度0.1 mg)、DF－20流水式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)、超聲波清洗儀(東莞市三源超聲波設備有限公司，頻率80KHZ，功率200W)、UV－2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

2 方法

2.1 提取工藝

2.1.1 提取溶劑的選擇

分別取栽培沉香葉粗粉約1 g，精密稱定，共4份，置50 mL錐形瓶。分別加入10 mL水、20%、50%、80% 乙醇，50℃超聲提取30 min，取出，冷卻，濾過，濾液置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。稀釋5倍，精密吸取稀釋液10 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，立即加入20% 硫酸溶液2 mL，振搖1 min，立即加入 0.02 mol·L－1高錳酸鉀溶液 0.05 mL，計時，當溶液的紫紅色完全消退時，記錄時間［2］。

2.1.2 提取方法的選擇

2.1.2.1 超聲提取法 取栽培沉香葉粗粉約1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，準確加入10 mL 50%乙醇，50℃超聲提取30 min，取出，冷卻，濾過，濾液置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。稀釋5倍，精密吸取稀釋液10 mL，按2.1.1節(jié)方法測定氧化時間。

2.1.2.2 回流提取法 取栽培沉香葉粗粉約1 g，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，準確加入10 mL 50% 乙醇，回流提取2 h，取出，冷卻，濾過，濾液置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。稀釋5倍，精密吸取稀釋液10 mL，按2.1.1節(jié)方法測定氧化時間。

2.1.3 正交試驗 以氧化時間為考察指標，以乙醇濃度、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)為因素，進行L9(34)正交試驗，因素和水平見表1。取栽培沉香葉粗粉約1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入溶劑，超聲提取，濾過，濾液置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，稀釋5倍，精密吸取稀釋液10 mL，按2.1.1節(jié)方法測定氧化時間，結(jié)果用正交設計助手Ⅱ軟件進行統(tǒng)計分析。

表1 正交試驗L9(34)的因素和水平表

2.2 沉香葉體外抗氧化活性

2.2.1 樣品溶液的制備 分別取野生沉香葉和栽培沉香葉粗粉各1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加入15 mL 60% 乙醇，50℃超聲提取40 min，濾過，濾液置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，稀釋5倍，搖勻，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取50 mg維生素C，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.3 氧化時間的測定 精密吸取待測溶液10 mL，按2.1.1節(jié)方法測定氧化時間。

2.2.4 超氧陰離子清除率的測定 精密吸取待測溶液1 mL，按文獻方法，于560 nm處測定吸光度，計算超氧陰離子清除率［4］。

2.2.5 總還原力的測定 精密吸取待測溶液0.1 mL，

按文獻方法，于 700 nm 處測定吸光值［5］。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取工藝

3.1.1 溶劑的選擇 在所考察的范圍內(nèi)，沉香葉的氧化時間在50% 時達到最低，表明50% 沉香葉提取液抗氧化能力最強，結(jié)果見表2。

表2 乙醇濃度對沉香葉氧化時間的影響結(jié)果(± s，n=3)

表2 乙醇濃度對沉香葉氧化時間的影響結(jié)果(± s，n=3)

乙醇氧化時間(s) 24.66 ±0.08 17.83 ±0.28 11.44 ±0.11 15.74 ±0.12溶劑 水 20%乙醇 50%乙醇 80%

3.1.2 提取方法的選擇 超聲提取法與回流提法對沉香葉提取工藝的影響，為配對試驗，采用配對t檢驗對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計處理，結(jié)果P＜0.01，說明兩組方法間有極顯著差異，即超聲提取法優(yōu)于回流提取法，結(jié)果見表3。

表3 提取方法對沉香葉氧化時間的影響結(jié)果(s)

3.1.3 正交試驗 氧化時間越少表明還原效果越好，抗氧化能力越強。離極差R的值越大，說明此因素對工藝的影響越大，由RA＞RB＞RD＞RC，可知影響工藝的主次順序為A(乙醇濃度)、B(溶劑用量)、D(提取次數(shù))、C(提取時間)。方差分析結(jié)果顯示各因素間沒有顯著差異，結(jié)合生產(chǎn)的實際情況，確定沉香葉的最佳提取工藝為A3B2C3D3，即以15倍60% 乙醇為溶劑，超聲提取40 min，提取1次，結(jié)果見表4和表5。

表4 正交試驗結(jié)果與直觀分析(± s，n=3)

表4 正交試驗結(jié)果與直觀分析(± s，n=3)

1 1 1 1 1 32.25 ±0.29 2 1 2 2 2 28.15 ±0.24 3 1 3 3 3 18.82 ±0.49 4 2 1 2 3 23.31 ±0.32 5 2 2 3 1 18.42 ±0.45 6 2 3 1 2 21.51 ±0.22 7 3 1 3 2 20.41 ±0.64 8 3 2 1 3 11.59 ±0.32 9 3 3 2 1 18.19 ±0.51 K1 26.407 25.323 21.783 22.953 K2 21.080 19.387 23.217 23.357 K3 16.730 19.507 19.217 17.907 R 9.677 5.936 4.000 5.450

表5 正交試驗方差分析表

3.2 沉香葉體外抗氧化活性

以最佳工藝對野生沉香葉和栽培沉香葉進行提取，并評價其體外抗氧化活性。氧化時間越少、超氧陰離子的清除率越大、總還力測定中吸光度越大，表明樣品的抗氧化能力越強。栽培沉香葉和野生沉香葉的氧化時間分別為11.53 s和9.98 s，少于《中國藥典》的參考值22 s［6］;超氧陰離子的清除率分別為36.26%和35.67%;總還原力測定中吸光度分別為0.188 和0.129，結(jié)果見表6。

表6 體外抗氧化活性結(jié)果(± s，n=3)

表6 體外抗氧化活性結(jié)果(± s，n=3)

與對照組比較，＊:P＜0.05;△:P＜0.01

吸光值栽培沉香葉 2 11.53 ±0.08＊ 36.26 ±0.96＊ 0.188 ±0.008樣品濃度(mg·mL －1)氧化時間(s)超氧陰離子的清除率(%)△野生沉香葉 2 9.98 ±0.16＊ 35.67 ±1.25＊ 0.129 ±0.011△維生素C 1 16.45 ±0.25 50.29 ±1.36 0.685 ±0.012

4 小結(jié)

分析了乙醇濃度和提取方法對沉香葉工藝影響的規(guī)律，結(jié)果表明60%乙醇為沉香葉的最佳提取溶劑，超聲提取法優(yōu)于回流提取法。由正交試驗可知沉香葉的最佳提取工藝為:以15倍量60%乙醇為溶劑，超聲提取40 min，提取1次，該提取工藝簡單、重復性好、提取液抗氧化活性強、工藝穩(wěn)定、無污染。3種體外抗氧化評價結(jié)果表明野生沉香葉和栽培沉香葉均具有較強的抗氧化活性。

［1］李錦開，李振紀.中國木本藥材與廣東特產(chǎn)藥材［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1994:110.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:172.

［3］中國藥科大學.一種沉香葉提取物及其醫(yī)藥和保健用途:中國，CN101011499［P］.2007－08－08.

［4］劉杰超，王思新，焦中高，等.蘋果多酚提取物抗氧化活性的體外試驗［J］.果樹學報，2005，22(2):106－110.

［5］徐亞民，馬 越，趙曉燕.紫蘇等4種天然色素抗氧化能力的比較［J］.華北農(nóng)學報，2007，22(2):187－190.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:336.