王 勇，范春林，王 英，葉文才，3*

(1.江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇南京210008;2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632;3.中國藥科大學(xué)天然藥化教研室，江蘇南京210009)

23－羥基白樺酸為從毛茛科植物白頭翁(Pulsatilla chinensis Regel)中提純制得的三萜類化合物是一治療腫瘤的中藥新藥的主要成分。體內(nèi)外抑瘤實(shí)驗(yàn)表明，23－羥基白樺酸對B16黑色素瘤細(xì)胞具有明顯的分化誘導(dǎo)作用，對體內(nèi)外黑色素瘤增殖有明顯的抑制作用。此外，23－羥基白樺酸對多種腫瘤細(xì)胞系如人胃癌SGC－7901、人卵巢癌AO、人白血病HL－60、人白血病K562、人宮頸癌Hela細(xì)胞及小鼠腹水瘤S180細(xì)胞等均有抑制作用［1－4］。本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對色譜條件進(jìn)一步優(yōu)化，對23－羥基白樺酸原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定及有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)進(jìn)行研究，為該藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent－1100高效液相色譜系統(tǒng)，G1311A泵、G1365B紫外檢測器、色譜工作站。

23－羥基白樺酸對照品(自制，純度＞98%，面積歸一化法測定)，常春藤皂苷元對照品(自制，純度＞98%，面積歸一化法測定)，23－羥基白樺酸原料藥 3 批(自制，批號(hào):050401、050402、050403);色譜純乙腈為Merck公司生產(chǎn)，色譜純甲醇為Dima公司生產(chǎn)，水為自制雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB－C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0.2%醋酸水溶液(62∶38);檢測波長 204 nm;流速:0.8 mL·min－1;柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 23－羥基白樺酸對照品溶液 精密稱取23－羥基白樺酸對照品適量，加甲醇超聲溶解并定量稀釋制成含23－羥基白樺酸0.10 mg·mL－1的溶液。

2.2.2 23－羥基白樺酸樣品溶液 精密稱取樣品10 mg，置于100mL的量瓶中，加甲醇超聲處理30 min溶解，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 最大吸收波長的測定

取23－羥基白樺酸對照品適量，照對照品溶液配制方法制成約含10 μg·mL－1的溶液，在波長190～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。23－羥基白樺酸在204 nm處有最大吸收，故將檢測波長定為204 nm。

2.4 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取幾種不同配比的乙腈－醋酸水溶液的流動(dòng)相，分離度均較好，故以峰的對稱因子為指標(biāo)，對本品的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，結(jié)果確定流動(dòng)相為乙腈－0.2%醋酸水溶液(體積比=62∶38)。

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈∶0.2%醋酸水溶液(體積比=62∶38)為流動(dòng)相，檢測波長為204 nm。理論板數(shù)按23－羥基白樺酸峰計(jì)算不低于10 000，主成分峰與雜質(zhì)峰的分離度＞1.5。

圖1 23－羥基白樺酸對照品和樣品的HPLC圖

2.6 線性范圍及定量限

精密稱取23－羥基白樺酸對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含0.201 6 mg的溶液。精密量取5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容，得到濃度為100.8 μg·mL－1的對照品溶液，再逐級(jí)稀釋，分別得到濃度為 40.32，20.16，10.08 μg·mL－1的溶液，分別取對照品溶液20 μL進(jìn)樣，依照上述色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:Y=19.5X+8.16，r=0.999 9。線性范圍為0.2016 ～4.032 μg 。

采用逐級(jí)稀釋法，當(dāng)信噪比(S/N)為10時(shí)，23－羥基白樺酸的定量限為70 ng。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取23－羥基白樺酸原料約10.0 mg，置于50 mL的量瓶中，加甲醇超聲處理30 min，放冷，稀釋至刻度，再取5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋，定容，過濾，取續(xù)濾液，精密20 μL，注入液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并計(jì)算，RSD=0.61%，表明本法精密度較高。

2.8 穩(wěn)定性考察

精密稱取23－羥基白樺酸原料，配成0.1 mg·mL－1溶液，分別在 0、2、4、8 h 進(jìn)樣，測得 23－羥基白樺酸面積，并計(jì)算RSD值，RSD=0.9%，表明本品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取23－羥基白樺酸原料6份，按含量測定項(xiàng)下的方法操作，測定并計(jì)算，其平均含量為80.9%，RSD=0.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量23－羥基白樺酸原料(批號(hào):050401)適量共 9份，分別精密加入含量的80%，100%和120%的23－羥基白樺酸對照品，按含量測定項(xiàng)下的方法操作，測定并計(jì)算，加樣回收率分別為 99.2%，101.7%，103.0%，平均回收率為101.9%;RSD 分別為 1.5%，1.1%，0.4%，平均RSD 為1.3%(n=3)。

2.11 含量測定

分別精密稱取3批23－羥基白樺酸樣品適量，加甲醇超聲溶解，并定量稀釋，制成含23－羥基白樺酸樣品0.1 mg·mL－1的溶液。分別精密吸取對照品溶液和樣品溶液，記錄色譜圖，測定23－羥基白樺酸的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算23－羥基白樺酸的含量。批號(hào) 050401，050402，050403，3批樣品的平均含量分別為 80.9%，81.3% 和 82.5%;RSD(n=3)分別為 1.0%，1.3%和 1.5%。

根據(jù)上述測定結(jié)果，確定本品含23－羥基白樺酸，以干燥品計(jì)，不得少于80%。

2.12 其他三萜檢查

本品中除有效成分23－羥基白樺酸外，還含有一種已知三萜，通過高效液相法，與對照品對照，鑒定其為常春藤皂苷元，通過文獻(xiàn)檢索未見其毒性報(bào)道。對其采用面積歸一化法進(jìn)行限度檢查，經(jīng)檢查，3批樣品的總雜質(zhì)含量均＜20%。

3 討論

23－羥基白樺酸屬三萜類化合物，紫外僅在末端有吸收且吸收較弱。由于甲醇的本底吸收較大，故選擇乙腈和水做為流動(dòng)相，為了獲得較好的峰形和對稱度，考慮在流動(dòng)相中加入一定量的醋酸，在對以流動(dòng)相進(jìn)行的系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)等大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確立了色譜條件為乙腈∶0.2%醋酸水溶液(體積比=62∶38)作為含量測定的條件。

本實(shí)驗(yàn)對23－羥基白樺酸原料藥的含量測定和有關(guān)物質(zhì)檢查進(jìn)行研究，建立了23－羥基白樺酸原料質(zhì)量控制的含量測定方法、雜質(zhì)常春藤皂苷元限度的控制標(biāo)準(zhǔn)，為23－羥基白樺酸原料藥的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。所建立的23－羥基白樺酸含量測定方法具有方法簡便，可靠，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。

［1］葉銀英，何道偉，葉文才，等.23－羥基樺木酸對B16細(xì)胞系的誘導(dǎo)分化作用［J］.中國生化藥物雜志，2001，22(4):163－165.

［2］葉銀英，何道偉，葉文才，等.23－羥基樺木酸體外抗惡性腫瘤作用的研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2001，20(3):14－16.

［3］Ye W C，Zhang Q，Hsiao W W，et al.New lupane glycosides from Pulsatilla chinensis［J］.Planta Med，2002，68:183－186.

［4］Liu W K，Ho J C，Cheung F W，et al.Apoptotic activity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cell line［J］.Eur J Pharmacol，2004，498:71－78.