楊振龍，吾魯木汗·那孜爾別克，2，恩特馬克·布拉提白，2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.伊犁師范學(xué)院生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000)

?

基于groEL基因序列鑒定丹毒絲菌屬菌種

楊振龍1，吾魯木汗·那孜爾別克1，2，恩特馬克·布拉提白1，2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.伊犁師范學(xué)院生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000)

對(duì)4株紅斑丹毒絲菌的16S rRNA基因和groEL基因進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析，探討groEL基因序列分析法在丹毒絲菌屬菌種分類鑒定中的應(yīng)用.測(cè)序結(jié)果表明，4株紅斑丹毒絲菌groEL基因長(zhǎng)度為1 614 bp，編碼由537個(gè)氨基酸殘基組成熱休克蛋白HPS60，與紅斑丹毒絲菌ATCC19414株和扁桃體丹毒絲菌ATCC43339株groEL基因的同源性分別為99%和86%，而16S rRNA基因長(zhǎng)度為1 351 bp，與紅斑丹毒絲菌ATCC19414株和扁桃體丹毒絲菌ATCC43339株的同源性均為99%.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，groEL基因比經(jīng)典的16S rRNA基因序列分析分辨率高，可適用于紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌的分類鑒定.

紅斑丹毒絲菌；扁桃體丹毒絲菌；16S rRNA基因；groEL基因；分類鑒定

丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)包括紅斑丹毒絲菌(E.rhusiopathiae)和扁桃體丹毒絲菌(E.tonsillarum)2個(gè)種，前者有16種血清型，后者有7種血清型.[1-2]紅斑丹毒絲菌能感染豬、鳥類和魚類等并導(dǎo)致畜禽的死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大損失[3].臨床研究表明，大約75%以上豬源分離菌株屬于血清型1和2紅斑丹毒絲菌，而其余血清型的紅斑丹毒絲菌在豬敗血癥、蕁麻疹、關(guān)節(jié)炎淋巴結(jié)炎和心內(nèi)膜炎中偶爾出現(xiàn)[4-5].國(guó)外學(xué)者從豬、牛、雞、魚的扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟等器官組織中分離得到扁桃體丹毒絲菌，但其對(duì)豬或雞沒有致病性[6-8].因此，建立紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的鑒定方法，顯得十分重要.

目前，用細(xì)菌分離培養(yǎng)、生理生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)等常規(guī)方法分離和鑒定丹毒絲菌屬菌種，但這些方法存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)和費(fèi)力等缺點(diǎn).近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者用多重PCR、DNA雜交和脈沖場(chǎng)電泳等分子生物學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確地區(qū)分紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌，但這些方法通常需要種特異性引物、雜交探針或多種限制性核酸內(nèi)切酶，并且不能做到同時(shí)鑒定[9-11].研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌rpoA，pyrH，gapA，topA和groEL等看家基因具有高度的保守性，同時(shí)，不同種屬細(xì)菌之間又存在相對(duì)穩(wěn)定的變異性，廣泛被用于細(xì)菌的種系發(fā)生學(xué)和分類學(xué)的鑒定上.因此，本研究基于groEL基因序列對(duì)4株紅斑丹毒絲菌、2株模式菌株和2株已完成全基因組測(cè)序的參考菌株進(jìn)行分類鑒定，并與16S rRNA基因序列分析法比較，評(píng)價(jià)groEL基因序列分析法用于紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌分類鑒定的可能性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 本研究所用供試菌C43065，C43311，C43309和C43001均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.據(jù)中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供的信息，這4株菌均分離自豬丹毒的血清型2的紅斑丹毒絲菌.

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基和BHI固體培養(yǎng)基均為Difco公司產(chǎn)品，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒、膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker和pMD18-T載體均購(gòu)自大連TaKaRa公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株基因組DNA的提取 用含體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween 80的BHI液體培養(yǎng)基(BHI-T)活化菌株，然后將菌株接種于新鮮BHI-T培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的使用說明書提取基因組DNA.

1.2.2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增 使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，經(jīng)PCR從4株紅斑丹毒絲菌細(xì)菌的基因組DNA中分別擴(kuò)增出16S rRNA基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.2.3groEL基因的PCR擴(kuò)增和克隆 根據(jù)紅斑丹毒絲菌Fujisawa全基因組序列(Accession No.AP012027)中g(shù)roEL基因序列設(shè)計(jì)引物GroEL-F(5′-ATGGCTAAAGATGTACGTTATGGAC-3′)和引物GroEL-R(5′-TTAATACATTGGCGGCATTTCAG-3′).PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.6 min，共循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min.通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用切膠回收試劑盒純化目的DNA片段，將其克隆到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，采用PCR鑒定重組質(zhì)粒pMD18-groEL.

1.2.4 DNA測(cè)序及Blast分析 將16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和重組質(zhì)粒pMD18-groEL送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用Blast軟件對(duì)目的基因序列進(jìn)行同源性分析.

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過Blast軟件分析從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與供試菌株16S rRNA基因序列和groEL基因序列同源性較高的模式菌株和參考菌株相應(yīng)基因序列，采用ClustalW軟件對(duì)比，并用MEGA4.0軟件計(jì)算進(jìn)化距離，運(yùn)用Neighhor-Joining法分別構(gòu)建16S rRNA基因和groEL基因的系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與討論

2.1 紅斑丹毒絲菌16S rRNA基因和groEL基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，用16S rRNA基因引物從4株紅斑丹毒絲菌基因組DNA中擴(kuò)增出1.5 kb左右的PCR產(chǎn)物(圖1)，而用groEL基因引物從4株紅斑丹毒絲菌基因組中擴(kuò)增出大小約為1.6 kb的PCR產(chǎn)物(圖1)，與預(yù)期的目的基因片段大小相符.

M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1—C43065；2—C43309；3—C43311；4—C43001；5—陰性對(duì)照.

2.2 16S rRNA基因序列的同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果表明，4株紅斑丹毒絲菌(C43065，C43309，C43311和C43001)16S rRNA基因序列長(zhǎng)度均為1 351 bp，與紅斑丹毒絲菌模式菌株ATCC19414和扁挑體丹毒絲菌模式菌株ATCC43339的相似度均為99%.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，C43065，C43309，C43311，C43001與紅斑丹毒絲菌參考菌株SY1027位于一個(gè)大分支，其中C43065和中國(guó)分離菌株SY1027[12]的親緣關(guān)系最近(圖2).但是，紅斑丹毒絲菌Fujisawa和ATCC19414與扁桃體丹毒絲菌ATCC43339和JPS251209S位于一個(gè)大分支，其中紅斑丹毒絲菌Fujisawa和ATCC19414的親緣關(guān)系最近(圖2).本試驗(yàn)結(jié)果表明，單純采用16S rRNA基因序列分析的方法，有可能使得紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌的鑒定不夠準(zhǔn)確.

圖2 丹毒絲菌屬菌種16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 groEL基因序列的同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果表明，4株紅斑丹毒絲菌groEL基因序列長(zhǎng)度均為1 614 bp，與紅斑丹毒絲菌Fujisawa和扁桃體丹毒絲菌 ATCC43339的相似度分別為98%和86%，說明紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌在groEL基因序列上存在較大的變異.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，C43065，C43309，C43311和C43001與紅斑丹毒絲菌ATCC19414，SY1027和Fujisawa位于一個(gè)大的分支，其中中國(guó)紅斑丹毒絲菌SY1027和日本紅斑丹毒絲菌Fujisawa的親緣關(guān)系最近(圖3).但4株供試菌株、1株紅斑丹毒絲菌模式菌株和2株參考菌株與扁桃體丹毒絲菌ATCC43339不再位于同一個(gè)分支上，說明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3).本試驗(yàn)結(jié)果表明，與16S rRNA基因序列分析相比，groEL基因序列分析能夠較好地運(yùn)用于紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌的鑒定.

圖3 丹毒絲菌屬菌種groEL基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 分析

紅斑丹毒絲菌是一種人畜共患傳染病的致病菌，能引起豬丹毒、雞敗血癥、人類心內(nèi)膜炎、魚類臟器出血和腎臟腫大等疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，也給世界食品安全帶來(lái)威脅[13-15].隨著規(guī)?；B(yǎng)豬發(fā)展，豬丹毒似乎逐漸淡出了人們的視線，急性典型的臨床病例發(fā)生比例越來(lái)越低，很多豬場(chǎng)已經(jīng)停止使用豬丹毒的弱毒疫苗.但是近年來(lái)，在湖南省、廣東省、安徽省、江西省等地區(qū)連續(xù)發(fā)生豬丹毒病[16-20]，豬丹毒似乎又有卷土重來(lái)的趨勢(shì).因此，建立紅斑丹毒絲菌的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的鑒定方法，能為豬丹毒病的防治提供十分重要的線索.

Makino S等[19]根據(jù)紅斑丹毒絲菌ATCC19414株16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物M0101和M0102，用其經(jīng)PCR從紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌基因組DNA中均能擴(kuò)增出407 bp的DNA片段，但從芽孢桿菌、腸球菌、豬鏈球菌、乳酸乳球菌、李斯特單核細(xì)胞增生菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA中不能擴(kuò)增任何DNA片段，說明基于16S rRNA基因的407 bp核苷酸序列只能鑒定丹毒絲菌，但不能區(qū)分紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌.Shimoji Y等[9]根據(jù)16S rRNA，23S rRNA和5S rRNA下游非編碼序列設(shè)計(jì)4對(duì)種特異性引物，用引物ER1F和ER1R從紅斑丹毒絲菌中擴(kuò)增出399 bp的DNA片段，用引物ER2F和ER2R從扁桃體丹毒絲菌中擴(kuò)增出384 bp的DNA片段，用引物ER3F和ER3R從丹毒絲菌屬血清型13菌株中擴(kuò)增出289 bp的DNA片段，而用引物ER4F和ER4R從丹毒絲菌屬血清型18菌株中擴(kuò)增出387 bp的DNA片段，表明用這4對(duì)引物經(jīng)PCR可以區(qū)分和鑒定紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌以及血清型13和18的菌株.后來(lái)Yamazaki Y[11]用引物ERY-1F和ERY-2R從紅斑丹毒絲菌基因組DNA中擴(kuò)增出2 210 bp的DNA片段，但從扁桃體丹毒絲菌基因組中沒有擴(kuò)增出任何片段，而用引物M0101和ERS-1R從紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌基因組DNA中均能擴(kuò)增出719 bp的DNA片段，說明用這2對(duì)引物經(jīng)多重PCR可以區(qū)分紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌.Gupta R S[20]報(bào)道熱休克蛋白HSP60是一種高度保守的蛋白質(zhì)，其編碼基因groEL是生物進(jìn)化中的保守成分，因此groEL基因適宜作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)志物.Kwok A Y等[21]的研究表明，groEL基因比DNA-DNA雜交和16S rRNA基因分析分辨率高，可適用于葡萄球菌屬菌種的分類鑒定研究.

筆者利用16SrRNA和groEL基因序列對(duì)紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.同源性分析結(jié)果顯示，4株紅斑丹毒絲菌groEL基因與已報(bào)道的紅斑丹毒絲菌ATCC19414和扁桃體丹毒絲菌ATCC43339的同源性分別為99%和86%，而4株紅斑丹毒絲菌16S rRNA基因與紅斑丹毒絲菌ATCC19414和扁桃體丹毒絲菌ATCC43339的同源性均為99%，表明groEL基因比16S rRNA基因序列分析具有更高的分辨率.從groEL基因系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株C43065，C43309，C43311和C43001與已報(bào)道紅斑丹毒絲菌模式菌株和參考菌株聚在一個(gè)大的分支上，而4株供試菌株、紅斑丹毒絲菌模式菌株和參考菌株與扁桃體丹毒絲菌模式菌株不在同一個(gè)分支上，表明紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).從16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，4株供試菌株與中國(guó)分離的紅斑丹毒絲菌參考菌株SY1027聚在一個(gè)大的分支上，而已報(bào)道的扁桃體丹毒絲菌ATCC43339和DSM14972與紅斑丹毒絲菌ATCC19414和Fujisawa聚在另一個(gè)分支上，其中菌株菌株ATCC19414和Fujisawa的親緣關(guān)系最近.研究結(jié)果表明，groEL基因比16S rRNA基因分析分辨率高，可適用于紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌的分類鑒定.

[1] TAKAHSHI T，F(xiàn)UJISAWA T，UMENO A，et al.A Taxonomic Study onErysipelothrixby DNA-DNA Hybridization Experiments with Nummerous Strains Isolated from Extensive Origins[J].Microbiology Immunology，2008，52(10):469-478.[2] FTHENAKIS G，CHRISTODOULOPOULOS G，LEONTIDES L，et al.Abortion in Ewes Associated withErysipelothrixRhusiopathiae[J].Small Ruminant Research,2006，63(1/2):183-188.

[3] ERIKSSON H，JANSSON D S，JOHANSSON K E，et al.Characterization ofErysipelothrixRhusiopathiaeIsolates from Poultry，Pigs，Emus，The Poultry Red Mite and Other Animals[J].Veterinary Microbiology，2009，137(1/2):98-104.[4] OPRIESSNIG T，HOFFMAN L J，HARRIS D L，et al.ErysipelothrixRhusiopathiae:Genetic Characterization of Midwest US Isolates and Live Commercial Vaccines Using Pulsed-Field Gel Electrophoresis[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2004，16(2):101-107.

[5] TAKAHASHI T，NAGAMINE N，KIJIMA M，et al.Serovars ofErysipelothrixStrains Isolated from Pigs Affected with Erysipelas in Japan[J].Journal Veterinary Medical Science，1996，58(6):587-589.

[6] TAKAHASHI T，TAKAGI M，YAMAOKA R，et al.Comparison of the Pathogenicity for Chickens ofErysipelothrixRhusiopathiaeandErysipelothrixTonsillarum[J].Avian Pathology，1994，23(2):237-245.

[7] COLAVITA G，VERGARA A，IANIERI A.Deferment of Slaughtering in Swine Affected by Cutaneous Erysipelas[J].Meat Science，2006，72(2):203-205.

[8] HASSANEIN R，SAWADA T，KATAOKA Y，et al.Pathogenicity for Mice and Swine ofErysipelothrixIsolates from the Tonsils of Healthy Cattle[J].Veterinary Microbiology，2003，91(2/3):231-238.

[9] SHIMOJI Y，MORI Y，HYAKUTAKE K，et al.Use of an Enrichment Broth Cultivation-PCR Combination Assay for Rapid Diagnosis of Swine Erysipelas[J].Journal of Clinical Microbiology，1998，36(1):86-89.

[10] OKATANI A T，UTO T，TANIGUCHI T，et al.Pulsed-Field Gel Electrophoresis in Differentiation ofErysipelothrixSpecies Strains[J].Journal of Clinical Microbiology，2001，39(11):4 032-4 036.

[11] YAMAZAKI Y.A Multiplex Polymerase Chain Reaction for DiscriminatingErysipelothrixRhusiopathiaefromErysipelothrixTonsillarum[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2006，18(4):384-387.

[12] KWOK A H，LI Y，JIANG J，et al.Complete Genome Assembly and Characterization of an Outbreak Strain of the Causative Agent of Swine Erysipelas-ErysipelothrixRhusiopathiaeSY1027[J].BMC Microbiology，2014，14:176.

[13] ERIKSSON H，JANSSON D S，JOHANSSON K E，et al.Characterization ofErysipelothrixRhusiopathiaeIsolates from Poultry，Pigs，Emus，the Poultry Red Mite and Other Animals[J].Veterinary Microbiology，2009，137(1/2):98-104.[14] FEASI M，BACIGALUPO L，CAPPATO S，et al.ErysipelothrixRhusiopathiaeIntra-Abdominal Abscess[J].International Journal Infectious Diseases，2010，14(1):81-83.

[15] 華 平，王 萌，劉家良，等.豬紅斑丹毒絲菌主動(dòng)脈瓣心內(nèi)膜炎一例報(bào)道及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2013，7(10):4 277-4 280.

[16] 何世成，談志祥，劉道新，等.3株豬紅斑丹毒絲菌湖南珠的分離與鑒定[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38(5):155-158.

[17] 張樂宜，蔡汝健，蔣智勇，等.豬紅斑丹毒絲菌GZ株的分離鑒定及序列分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23(7):31-38.

[18] 陸 萍，黃曉慧，李春芬，等.安徽部分地區(qū)豬丹毒桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2014，41(9):1 822-1 828.

[19] MAKINO S，OKADA Y，MARUYAMA T，et al.Direct and Rapid Detection ofErysipelothrixRhusiopathiaeDNA in Animals by PCR[J].Journal Clinical Microbiology，1994，32(6):1 526-1 531.

[20] GUPTA R S.Evolution of the Chaperonin Families (Hsp60，Hsp10 and Tcp-1) of Proteins and the Origin of Eukaryotic Cells[J].Molecular Microbiology，1995，15(1):1-11.

[21] KWOK A Y，SU S C，REYNOLDS R P，et al.Species Identification and Phylogenetic Relationships Based on Partial HSP60 Gene Sequences Within the GenusStaphylococcus[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49:1 181-1 192.

(責(zé)任編輯 陳炳權(quán))

Classification and Identification of the Erysipelothrix Species Strains Based on thegroELGene Sequences

YANG Zhenlong1，NAZIERBIEKE Wulumuhan1，2，BORRATHYBAY Enotmack1，2

(1.College of Biology and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou 416000，Hunan China;2.College of Biological and Geography Sciences，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang China)

To investigate the effect of 16S rRNA gene andgroELgene used in the classification and identification of species of the genusErysipelothrix，the 16S rRNA andgroELgenes of fourE.rhusiopathiaestrains were amplified by PCR and sequenced and their phylogenetic threes was constructed.The open reading frame ofgroELgenes of four tested strains were 1 614 bp in length，and sequence similarities of thegroELgene between the four tested strains and the previously reportedE.rhusiopathiaetype strain ATCC19414 andE.tonsillarumtype strain ATCC43339 were 99% and 86%，respectively.While the 16S rRNA genes of the four tested strains was 1 351 bp in length，and sequence similarity of the 16S rRNA gene between the four tested strains andE.rhusiopathiaetype strain ATCC19414 andE.tonsillarumtype strain ATCC43339 was 99%.Phylogenetic analysis indicated that theE.rhusiopathiaeandE.tonsillarumwere differentiated well bygroELgene sequence analysis.This study demonstrated that thegroELgene is an alternative phylogenetic marker for the classification of species of the genusErysipelothrix.

Erysipelothrixrhusiopathiae；Erysipelothrixtonsillarum；16S rRNA;groEL；classification and determination

1007-2985(2015)04-0054-05

吾魯木汗·那孜爾別克(1961—)，女，新疆塔城托里人，新疆伊犁師范學(xué)院生物與地理科學(xué)學(xué)院教授，博士，主要從事病原微生物致病機(jī)理研究.

Q939.1

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2015.04.014