楊海東， 林碧蓮 (莆田學院醫(yī)學院生理學教研室， 莆田 3500;莆田學院醫(yī)學院附屬醫(yī)院保健科)

人參皂苷Rg1拮抗MPTP誘導小鼠黑質(zhì)中鐵增高的作用

楊海東1， 林碧蓮2(1莆田學院醫(yī)學院生理學教研室， 莆田 351100;2莆田學院醫(yī)學院附屬醫(yī)院保健科)

目的 研究人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)對1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶(1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)致帕金森病(Parkinson’s disease，PD)小鼠黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性的保護作用及其可能機制。 方法 C57BL6小鼠隨機分為正常對照組(NS，i.p.)、MPTP組(30 mg/kg×5 d，i.p.)及 Rg1(5 mg/kg×8 d，i.p.)預處理組。應用免疫組織化學法、Perls’鐵染色、逆轉錄－聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及圖像分析等技術觀察黑質(zhì)內(nèi)多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter，DAT)免疫反應活性變化、鐵染色陽性細胞數(shù)的變化和DAT mRNA的表達水平的變化，用高效液相色譜法(HPLC)檢測小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝物二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)含量。 結果 與正常對照組相比，MPTP組黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細胞數(shù)增高以及紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量明顯減少;與MPTP組相比，Rg1預處理組黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細胞數(shù)降低以及紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量明顯增加(P＜0.01)。與正常對照組相比，MPTP組黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應活性和DAT mRNA的表達明顯降低(P＜0.01);與MPTP組相比，Rg1預處理組黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應活性和DAT mRNA的表達有所增高(P＜0.05)。 結論 Rg1對MPTP致PD小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護作用，其機制可能與Rg1能通過降低MPTP誘導的鐵過多聚積從而拮抗氧化應激反應有關。

帕金森病;1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶; 人參皂苷Rg1; 多巴胺轉運蛋白; 鐵

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是一種常見的中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，嚴重影響病人生存質(zhì)量，50歲以上人群發(fā)病率約1% －2%［1］。PD主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元進行性變性、脫失及伴發(fā)黑質(zhì)(substantia nigra，SN)、紋狀體(striatum)軸突末梢DA耗竭，從而導致基底節(jié)神經(jīng)功能的紊亂［2］。早在1924年就有學者發(fā)現(xiàn)PD病人黑質(zhì)中鐵含量明顯高于正常人，隨著研究的進展，人們逐漸認識到鐵在PD的發(fā)病機制中起到關鍵的作用［3］。多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter，DAT)是中樞DA能神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白，是突觸前膜再攝取釋放至突觸間隙DA的物質(zhì)基礎，是反映含DA神經(jīng)末梢部位活性的良好指標［4］。

目前，PD的治療多采用DA的替代療法即服用DA的前體左旋多巴，來彌補腦內(nèi)DA不足，以改善臨床癥狀，但這并不能阻止DA能神經(jīng)元的繼續(xù)凋亡，而且DA本身也可誘導神經(jīng)元的凋亡，左旋多巴的這些副作用也極大地限制了它的應用。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)是近年來研究較多的一種人參單體，藥理研究表明它具有抗神經(jīng)細胞凋亡、抗衰老、抗氧化、提高免疫力和類雌激素等作用［5，6］。故實驗旨在進一步探討人參皂苷Rg1對黑質(zhì)內(nèi)DA的保護作用并探討其可能機制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性C57BL小鼠，10－12周，體重(21±2)g，雄性，36只，購自北京維通利華動物實驗中心，動物合格證號:SCXK(京)2002－0003。

1.2 藥物與試劑 MPTP、DA、DOPAC、HVA、DAT抗體(Sigma公司)，人參皂苷Rg1(美國LKT Laboratories公司產(chǎn)品)，DAB試劑盒(北京中杉試劑公司)，Trizol試劑(GIBCO公司)，逆轉錄試劑盒(PROMEGA公司)，Tag DNA聚合酶、DNA Marker-DL2000(TAKARA公司)。

1.3 儀器 臺式低溫離心機(德國Eppendorf產(chǎn)品);DNA thermal cycler(Peltier公司);電泳儀(Amershan Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品);紫外凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件(上海天能Tanon公司產(chǎn)品);冰凍切片機(德國Leitz公司制造);高效液相色譜儀(美國Waters公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將小鼠隨機分為3組，每組12只，其中6只用于斷頭取腦紋狀體和黑質(zhì)活組織，6只用于腦灌注固定做腦切片。置于室溫(19±2)℃，12:12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由飲水、取食。動物于實驗前適應實驗室環(huán)境一周。MPTP模型組:每天上午10:00腹腔注射(i.p.)MPTP(30 mg/kg)，連續(xù)5 d;Rg1預處理組:每天上午8:00先行腹腔注射Rg1(5 mg/kg)，連續(xù)3 d，其后于上午8:00腹腔注射Rg1(5 mg/kg)及10:00腹腔注射MPTP(30 mg/kg)，連續(xù)5 d;正常對照組:腹腔注射等體積生理鹽水溶液。

2.2 免疫組織化學(IHC)測定 于末次注射24 h后用8%的水合氯醛腹腔注射麻醉，400 mg/kg，將小鼠深度麻醉后斷頭取腦固定，修整中腦組織塊進行冠狀連續(xù)冰凍切片，參照試劑盒說明進行DAT免疫組織化學染色。

2.3 鐵染色 上述切片同樣用于Fe3+的染色。切片在含有2%HCl與2%亞鐵氰化鉀等體積混合液(新鮮配置)30 min，PBS沖洗后浸泡在1%H2O2中去除內(nèi)源性過氧化物酶，在含有0.25 mg/ml DAB和0.02%(V/V)H2O2的PBS溶液中顯色10 min。

2.4 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測腦內(nèi)DAT mRNA在黑質(zhì)中的表達

2.4.1 總RNA的提取 于末次注射24 h后將小鼠斷頭處死快速取出黑質(zhì)組織，加入Trizol試劑提取總RNA。

2.4.2 逆轉錄反應(cDNA的合成) 利用逆轉錄試劑盒要求的標準條件進行RNA逆轉錄。反應體系為 20 μl，42 ℃反應 1 h，99 ℃加熱 5 min，然后快速冷卻到4℃以滅活逆轉錄酶與cDNA結合，反轉錄得到的cDNA用作PCR反應模板，或暫放－20℃保存。

2.4.3 聚合酶鏈反應(PCR反應)PCR引物分別參照文獻設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(見表1)。采用25 μl反應體系進行擴增，DAT、GAPDH基因的擴增參數(shù)為94℃預變性4 min，94℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，反應35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

表1 DAT、GAPDH基因的引物Tab 1 The primers of DAT，GAPDH genes

2.4.4 PCR產(chǎn)物定量分析 取擴增產(chǎn)物于含溴化乙錠(ethidium bromide，EB)(0.5 μg/ml)的 2% 的瓊脂糖凝膠中電泳，80 V，25 min，運用軟件對條帶進行分析。每份樣本分別得到DAT和GAPDH基因的特異性擴增條帶，用DAT與GAPDH比值表示DAT基因的表達水平。

2.5 高效液相色譜電化學檢測法(high performance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)檢測紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物

2.5.1 色譜柱條件 流動相:檸檬酸(H2O)4.202 8 g;乙酸鈉6.804 g;EDTA·2Na(2H2O)49.87 mg;八烷基磺酸鈉(H2O)(OSA)811.275 mg;二正丁胺(0.17 ml);甲醇 50 ml，用雙蒸水(ddH2O)稀釋至1 000 ml。最大柱壓 2 500 psi，流速 1.0 ml/min，ECD設定電壓0.65 V，每一樣品檢測35 min。

2.5.2 組織樣品的預處理 樣品轉入2.0 ml Eppendorf管中，準確稱量，加入冰冷的樣品預處理A液 300 μl，冰浴中超聲 10 s(1 Hz，即振動 1 s，間歇 1 s，反復4－5次)，冰浴靜置 1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取240 μl上清液轉入另一 Eppendorf管中再加入120 μl冰冷的預處理B液，渦旋混勻，冰浴靜置1 h，4℃12 000 r/min離心20 min后置－80℃冷凍保存待測。

2.6 統(tǒng)計學分析實驗結果以±s表示，應用SPSS12.0軟件包進行單因素方差分析(one-way ANOVA)中Student-Newman-Keuls法檢驗。

3 結果

3.1 Rg1對MPTP PD模型小鼠DAT免疫反應活性影響 MPTP模型組與正常對照組相比，黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應活性降低了53.8%(P＜0.01)，鐵染色陽性細胞數(shù)明顯增多(P＜0.01);經(jīng)Rg1預處理后上述結果較模型組有所改善(P＜0.01)，但DAT免疫反應活性仍低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表2、圖1、圖2。

表2 Rg1對MPTP PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)DAT免疫反應活性鐵染色陽性細胞數(shù)的影響(±s，n=6)Tab 2 Effect of Rgl on the DAT immunoreactive staining and iron staining in the substantia sigra of MPTP Parkinson disease mice(±s，n=6)

表2 Rg1對MPTP PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)DAT免疫反應活性鐵染色陽性細胞數(shù)的影響(±s，n=6)Tab 2 Effect of Rgl on the DAT immunoreactive staining and iron staining in the substantia sigra of MPTP Parkinson disease mice(±s，n=6)

組別 DAT免疫反應結合率%鐵染色陽性細胞數(shù)正常對照組2.47 ±0.07 12.04 ±1.35 MPTP 模型組 1.14 ±0.08* 33.18 ±2.56*Rg1 預處理組 1.93 ±0.07*# 17.54 ±2.09*#

與正常對照組相比，*P＜0.01;與MPTP模型組相比，#P＜0.01

圖1 小鼠黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫組織化學染色(40×10)Fig 1 DAT expression in the substantia nigra of mice(40×10)

圖2 小鼠黑質(zhì)內(nèi)鐵免疫組織化學染色(40×10)Fig 2 Iron staining in the substantia nigra of mice(40×10)

3.2Rg1對MPTP PD模型小鼠 黑質(zhì)DAT mRNA表達的影響MPTP模型組與正常對照組相比DAT mRNA擴增產(chǎn)物明顯減少(0.469 ±0.228vs1.175 ±0.322，P＜0.05);經(jīng)Rg1預處理后DAT mRNA擴增產(chǎn)物(0.981±0.206)較 MPTP模型組有所增多(P＜0.05)。但經(jīng)Rg1預處理后與正常對照組相比仍有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見圖3。

3.3 Rg1對MPTP PD模型小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響 MPTP模型組DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA的含量與正常對照組相比分別下降了 72.51%，43.85%，65.89%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Rg1預處理組DA、DOPAC和HVA的含量較MPTP模型組均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Rg1預處理組DA、DOPAC和HVA的含量仍低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，見表 3)。

圖3 各組鼠黑質(zhì)內(nèi)DAT cDNA擴增產(chǎn)物電泳圖Fig 3 Amplified products of DAT cDNA in substantia sigra of mice by electrophoresis

表3Rg1對MPTP PD模型小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響(ng/mg，±s，n=6)Tab 3Effect of Rgl on the contents of DA and its metabolites in the striatum of MPTP PD model mice(ng/mg，±s，n=6)

表3Rg1對MPTP PD模型小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響(ng/mg，±s，n=6)Tab 3Effect of Rgl on the contents of DA and its metabolites in the striatum of MPTP PD model mice(ng/mg，±s，n=6)

與正常對照組相比，*P＜0.01;與MPTP模型組相比，#P＜0.05

組別DA DOPAC HVA正常對照組17.672 ±1.095 2.148 ±0.137 1.202 ±0.115 MPTP 模型組 4.857 ±0.549* 1.206 ±0.071* 0.410 ±0.048*Rg1 預處理組 12.025 ±1.161*# 1.638 ±0.403*# 0.911 ±0.086*#

4 討論

MPTP可導致黑質(zhì)－紋狀體系統(tǒng)內(nèi)DA能神經(jīng)元的損傷、線粒體能量耗竭和氧化應激反應等作用，并且它已作為一種可用于誘導制備PD模型并能模擬出人類PD癥狀的神經(jīng)毒性物質(zhì)有幾十年了［7，8］。兒茶酚胺降解酶、單胺氧化酶B可將MPTP轉變成有毒性的代謝產(chǎn)物MPP+。DA能神經(jīng)元末梢可通過細胞膜上的DAT特異性攝取MPP+，因此MPTP的毒性作用不僅作用于紋狀體，而且還可以作用于黑質(zhì)。MPP+可通過在線粒體內(nèi)膜堆積從而抑制復合物NADH脫氫酶的活性，干擾氧化磷酸化作用，阻斷了電子傳遞而減少ATP的合成導致ATP不足，從而導致DA能神經(jīng)元損傷。

DA的代謝不僅可通過神經(jīng)末梢突觸前膜的DAT作用被重攝取至囊泡中貯存，還可通過兒茶酚胺氧位甲基轉移酶和單胺氧化酶B被代謝成為DOPAC和HVA。正常生理情況下，突觸間隙DA功能的消失主要是通過前者實現(xiàn)的。DAT是位于中樞DA神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白，屬于Na+、Cl－依賴性膜轉運體基因家族，是調(diào)節(jié)和維持DA神經(jīng)遞質(zhì)的重要因子，它的功能活動、密度變化反映了DA遞質(zhì)系統(tǒng)功能［9］。近年來的研究表明，早期PD患者的DAT水平明顯降低，臨床研究也顯示DAT的改變與PD的嚴重程度有著良好的相關性，早期PD病人的基底節(jié)區(qū)DAT就較正常下降了31%－65%;研究還表明，DAT合成并表達于DA能神經(jīng)元胞體、樹突、軸突，然后被運輸?shù)綐渫荒ぁ⑤S突膜上，因而中腦黑質(zhì)區(qū)具有較高的DAT mRNA轉錄［10］。本實驗也觀察到MPTP可造成小鼠黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應活性下降了53.8%以及DAT mRNA的表達下降，與上述結果相符。同時，本實驗結果還表明，MPTP可導致小鼠紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA 的含量分別下降 72.51%，43.85%，65.89%。應用Rg1處理后上述指標有所改善，說明Rg1對DA神經(jīng)元具有保護作用。

在體內(nèi)鐵是一種重要的微量金屬元素，它在氧的轉運、電子傳遞和DNA合成等生物學功能中起著重要的作用。實驗研究表明在黑質(zhì)內(nèi)，DA由單胺氧化酶B誘發(fā)的氧化脫胺及自身氧化生成黑色素的過程中都能產(chǎn)生H2O2。由Fe3+還原生成的Fe2+可與H2O2反應，再通過Fenton反應，H2O2+Fe2+→OH·+OH－+Fe3+，生成具有高度細胞毒作用的OH·，從而造成線粒體和其他細胞成分的損傷導致DA能神經(jīng)元的死亡［11］。黑質(zhì)內(nèi)鐵的增多可破壞機體內(nèi)氧化機制與抗氧化機制之間的平衡，導致氧化應激反應發(fā)生，引起細胞損傷;同時在線粒體呼吸鏈中，氧接受一個電子形成超氧陰離子O2·，O2·在過氧化物歧化酶的作用下可生成H2O2，而O2˙本身可促進Fe3+由其鐵結合蛋白上的釋放，從而加速了OH·的生成，進一步造成DA能神經(jīng)元死亡。有相關報道表明MPTP可以通過氧化應激反應而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，這可能與MPTP增高鐵積聚密切相關，體外實驗也證實Fe2+可以使MPTP轉化成MPP+，結果使Fe3+增高，從而產(chǎn)生氧化應激反應并與細胞毒性氧自由基相互作用而導致DA能神經(jīng)元的損傷［12］。本實驗結果顯示MPTP可導致小鼠黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細胞數(shù)增高，這與本室前期研究結果相符［3，13］，說明 MPTP 可以通過增高鐵積聚導致氧化應激從而促使DA能神經(jīng)元變性死亡。

本研究應用Rg1處理后觀察到小鼠紋狀體內(nèi)DA及代謝物含量、黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應活性和DAT mRNA表達水平均比MPTP組明顯升高，黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細胞數(shù)明顯少于MPTP組;我們推測Rg1可能是通過降低MPTP誘導的鐵過多聚積從而拮抗氧化應激反應，起到保護黑質(zhì)DA神經(jīng)元的作用。

總之，MPTP可導致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性、壞死，Rg1對MPTP致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護作用，其機制可能與Rg1抗氧化應激反應有關。

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The role of ginsenoside Rg1 in antagonism of MPTP-induced iron accumulation in substantia nigra of mice

YANG Hai-dong1，LIN Bi-lian2(1Dept of Physiology，Medical College of Putian University，Putian 351100，China;2Dept of Health Care，The Affiliated Hospital of Medical College of Putian University)

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra in 1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP)treated C57BL6 mice.MethodsMice were randomly divided into three groups:normal group，MPTP group and Rg1 pretreatment group.The mice were injected intraperitoneally with normal saline in normal group，30 mg/kg MPTP for 5 d in MPTP group，and 5 mg/kg Rg1 for 8 d and 30 mg/kg MPTP for 5 d in Rg1 pretreatment group，respectively.RT-PCR，immunohistochemistry，Perls’iron staining were used to observe the immunoreactive staining of dopamine transporter(DAT)protein，iron-positive cells and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，respectively.HPLC was used to detect the contents of dopamine and its metabolites，dihydroxyphenylacetic acid and homovanillic acid in striatum of mice.ResultsThe DAT immunoreactive staining and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，and the contents of dopamine and its metabolites in the striatum were significantly lower in MPTP group than in control group(P＜0.01)，while iron staining was significantly higher(P＜0.01).Compared with MPTP group，the DAT immunoreactive staining and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，and the contents of dopamine and its metabolites in the striatum increased significantly(P＜0.05 orP＜0.01)，while iron staining significantly decreased(P＜0.01).ConclusionGinsenoside Rg1 could protect against the MPTP-induced neurotoxicity of dopaminergic neurons in PD mice by decreasing the MPTP-induced iron accumulation for inhibiting the oxidative stress reaction.

Parkinson’s disease;1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP);ginsenoside Rg1;dopamine transporter;iron

R741.02

A

1007 －6611(2011)01 －0010 －05

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.003

莆田市科技計劃項目基金資助項目(2009S02(3))

楊海東，男，1976－02生，碩士，講師，E-mail:yhdzlx999890@163.com.

2010－11－11］