張平安， 祁亞斌 (西安市紅十字會醫(yī)院中醫(yī)骨科， 西安 70054;西安市第九醫(yī)院普外二科;通訊作者，E-mail:qiyabin975@63.com)

抗凝血酶Ⅲ對大鼠脊髓損傷保護作用的實驗研究

張平安1， 祁亞斌2*(1西安市紅十字會醫(yī)院中醫(yī)骨科， 西安 710054;2西安市第九醫(yī)院普外二科;*通訊作者，E-mail:qiyabin1975@163.com)

目的 研究抗凝血酶Ⅲ對大鼠繼發(fā)性脊髓損傷的保護作用及其機制。 方法 SD大鼠36只，隨機分為假手術(shù)組、損傷組、治療組(n=12)。采用Allen’s撞擊法建立脊髓損傷模型，假手術(shù)組僅咬除椎板，不損傷脊髓。治療組在脊髓損傷后15 min腹腔注射抗凝血酶Ⅲ250 IU/kg。術(shù)后24 h取脊髓組織測定髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);24 h、1周、2周、3周行斜板試驗和BBB評分。 結(jié)果 損傷組較假手術(shù)組MPO、MDA升高，SOD降低(P＜0.01);治療組較損傷組MPO、MDA降低，SOD升高(P＜0.01)，且行為學評分佳(P＜0.05)。 結(jié)論 抗凝血酶Ⅲ對大鼠脊髓繼發(fā)性損傷有保護作用，其機制與抑制中性粒細胞介導的免疫炎癥反應有關(guān)。

脊髓損傷; 中性粒細胞; 髓過氧化物酶; 抗凝血酶Ⅲ

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后引起繼發(fā)性脊髓損傷，進一步加重神經(jīng)功能障礙，其病理生理過程復雜，病理機制尚不完全清楚，中性粒細胞介導的免疫炎癥反應是一個重要機制［1，2］。近年研究證實較大劑量的抗凝血酶Ⅲ能促進前列環(huán)素(PGI2)的生成，從而抑制中性粒細胞活性增高所致的免疫炎癥反應。本實驗通過對大鼠脊髓損傷后腹腔注射抗凝血酶Ⅲ，研究其對繼發(fā)性脊髓損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 普通級SD大鼠，體重280－320 g，雌雄不限，由東南大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，隨機分3組，每組各12只。假手術(shù)組:僅咬除椎板，不損傷脊髓。損傷組:造模后15 min給大鼠腹腔注射生理鹽水2 ml。治療組:造模同損傷組，傷后15 min給大鼠腹腔注射抗凝血酶Ⅲ250 IU/kg。各組分別于手術(shù)后24 h隨機處死6只，取脊髓組織測定髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);剩余6只于24 h、1周、2周、3周行斜板試驗和BBB評分。

1.2 動物造模 采用Allen’s撞擊法建立脊髓損傷模型。以戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉，取背部正中切口，咬除胸10棘突和椎板，暴露硬膜，取重10 g、直徑2.5 mm的金屬棒從2.5 cm高度沿玻璃管垂直自由落下，砸傷胸10節(jié)段脊髓，造成大鼠不全性截癱。造模成功的標志是:撞擊的脊髓組織充血水腫，雙下肢及身體回縮，尾巴痙攣擺動。然后縫合切口。

1.3 MPO、SOD、MDA測定 戊巴比妥鈉麻醉后，大出血處死，以手術(shù)區(qū)為中心，取脊髓組織長約1.5 cm，制備組織勻漿，按 MPO、SOD、MDA測試盒(南京建成生物工程研究所)說明檢測。

1.4 斜板試驗 將大鼠縱軸與斜板縱軸一致，斜板每次升高5度，記錄大鼠能停留5 s的最大夾角。

1.5 BBB評分 將動物置于直徑2 m的平面光滑場地自由活動，觀察后肢的關(guān)節(jié)活動、步態(tài)等運動功能4 min，由熟悉該評分系統(tǒng)的非本實驗人員進行盲法評分。第一步(0－7分)評判動物后肢各關(guān)節(jié)活動;第二步(8－13分)評判動物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能;第三步(14－21分)評判動物運動中爪的精細動作，三項滿分 21 分［3］。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有參數(shù)以±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓組織 MPO、SOD、MDA測定 損傷組中MPO、MDA水平較假手術(shù)組明顯升高，SOD水平明顯(P＜0.01，見表1)。而治療組的MPO、MDA較損傷組明顯降低，SOD水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，見表1)。

表1 傷后24 h脊髓組織中MPO、SOD、MDA的含量(n=6±s)Tab 1 The results of MPO，SOD，MDA activities in injuried spinal cord at 24 h after injury(n=6，±s)

表1 傷后24 h脊髓組織中MPO、SOD、MDA的含量(n=6±s)Tab 1 The results of MPO，SOD，MDA activities in injuried spinal cord at 24 h after injury(n=6，±s)

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與損傷組比較，#P ＜0.01

組別 MPO/(U/g組織)SOD/(U/mg蛋白)MDA/(nmol/mg蛋白)假手術(shù)組1.826 ±0.087 226.2 ±13.8 19.38 ±1.42損傷組 3.108 ±0.164* 130.5 ±10.3* 42.88 ±2.40*治療組 2.494 ±0.086# 184.2 ±9.4# 27.39 ±2.16#

2.2 行為學評估 損傷組斜板試驗和BBB評分在術(shù)后24 h、1周、2周、3周均明顯差于假手術(shù)組，而治療組斜板試驗和BBB評分在術(shù)后24 h、1周、2周、3周均明顯優(yōu)于損傷組，而且差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表 2，3)。從術(shù)后 24 h至術(shù)后3 周動物的行為學評估逐漸好轉(zhuǎn)，治療組在術(shù)后3周已接近于正常，斜板試驗評價與假手術(shù)組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但BBB評分仍有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見表2，3。

表2三組大鼠傷后斜板試驗結(jié)果(度，n=6，±s)Tab 2The results of inclined-plane test in rats(degrees，n=6，±s)

表2三組大鼠傷后斜板試驗結(jié)果(度，n=6，±s)Tab 2The results of inclined-plane test in rats(degrees，n=6，±s)

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與損傷組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 術(shù)后24 h 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后3周假手術(shù)組 57.50 ±5.24 59.37 ±3.16 58.33 ±4.08 60.00 ±4.47損傷組 32.50 ±2.74* 39.17 ±3.76* 40.00 ±3.16* 49.17 ±3.76*治療組 36.67 ±2.58*# 49.17 ±8.04*## 50.00 ±4.47*## 58.33 ±4.08##

表3三組大鼠傷后BBB評分結(jié)果(分，n=6，±s)Tab 3The results of BBB scales in rats(scores，n=6，±s)

表3三組大鼠傷后BBB評分結(jié)果(分，n=6，±s)Tab 3The results of BBB scales in rats(scores，n=6，±s)

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05;與損傷組比較，△P＜0.01

組別 術(shù)后24 h 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后3周假手術(shù)組21 21 21 21損傷組 2.83 ±0.75* 7.67 ±0.82* 10.17 ±1.17* 13.17 ±0.98*治療組 6.33 ±0.82＊△ 10.83 ±0.98＊△ 13.17 ±0.75＊△ 18.50 ±1.05＊＊△

3 討論

脊髓損傷后，TNF-α、IL-1、IL-6等促炎癥反應因子增多，使中性粒細胞黏附于內(nèi)皮細胞，兩者相互作用，內(nèi)皮細胞損傷，通透性增加，中性粒細胞活化，浸潤到局部組織，釋放彈性蛋白酶、氧自由基等多種炎癥介質(zhì)，自由基能結(jié)合細胞膜的多不飽和脂肪酸，從而啟動脂質(zhì)過氧化反應，引起繼發(fā)性脊髓損傷［4，5］。MPO活性的高低代表中性粒細胞的數(shù)量和活性，MDA是脂質(zhì)過氧化的基本代解產(chǎn)物，其水平的檢測常作為脂質(zhì)過氧化指標。故而脊髓損傷后MPO、MDA升高。SOD是超氧陰離子清除劑，機體為了清除過多的自由基，必然消耗大量的SOD，引起SOD下降。

抗凝血酶Ⅲ是一種α2－球蛋白，是凝血酶和其他絲氨酸蛋白酶的生理性抑制劑，其抗凝作用人們熟知，已成功用于彌散性血管內(nèi)凝血的治療。近年研究［6，7］證實，較大劑量的抗凝血酶Ⅲ能促進血管內(nèi)皮細胞釋放前列環(huán)素，而前列環(huán)素能抑制促炎癥反應介質(zhì)，保護血管內(nèi)皮細胞，阻斷活化的中性粒細胞與內(nèi)皮細胞黏附，并能夠抑制活性氧和中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放，從而抑制中性粒細胞活性增高所致的免疫炎癥反應。故而理論上抗凝血酶Ⅲ應該對脊髓損傷有良好的治療作用。

本實驗中，脊髓損傷后應用抗凝血酶Ⅲ治療較未治療者，組織中MPO、MDA明顯降低，SOD明顯升高，說明抗凝血酶Ⅲ可能通過促進血管內(nèi)皮細胞釋放前列環(huán)素，從而抑制中性粒細胞活化，減輕炎癥反應，減少氧自由基的產(chǎn)生，緩解SOD的消耗，同時脂質(zhì)過氧化反應減輕，MDA等產(chǎn)物減少。

在大鼠的行為學評估中，脊髓損傷后24 h、1周、2周、3周斜板試驗和BBB評分均顯示抗凝血酶Ⅲ治療組明顯優(yōu)于損傷組，且功能恢復更快。這進一步證實抗凝血酶Ⅲ對大鼠繼發(fā)性脊髓損傷有保護作用，也說明中性粒細胞在繼發(fā)性脊髓損傷的病理機制中發(fā)揮重要作用，可通過抑制其活性，減輕免疫炎癥反應，減少繼發(fā)性損傷，從而改善功能恢復。Arai等［8］在大鼠脊髓損傷前應用抗凝血酶Ⅲ，發(fā)現(xiàn)治療組的運動功能、脊髓誘發(fā)電位、組織學改變均明顯優(yōu)于損傷組。

綜上所述，抗凝血酶Ⅲ對大鼠脊髓繼發(fā)性損傷有保護作用，其機制與抑制中性粒細胞介導的免疫炎癥反應有關(guān)。

［1］ Beck KD，Nguyen HX，Galvan MD，et al.Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury:evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment［J］.Brain，2010，133(Pt2):433 －447.

［2］ 祁亞斌，吳小濤，付文芹，等.大鼠不同程度脊髓損傷后的中性粒細胞活性［J］.中國臨床康復，2006，10(28):91 －93.

［3］ Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma，1995，12(1):1 －21.

［4］ Yang L，Blumbergs PC，Jones NR，et al.Early expression and cellular localization of proinflammatory cytokines interleukin-1［beta］，interleukin-6，and tumor necrosis factor-［alpha］ in human traumatic spinal cord injury［J］.Spine，2004，29(9):966 －971.

［5］ Ghasemlou N，Bouhy D，Yang J，et al.Beneficial effects of secretory leukocyte protease inhibitor after spinal cord injury［J］.Brain，2010，133(1):126 －138.

［6］ Okajima K，Uchiba M.The anti-inflammatory properties of antithrombin Ⅲ:New therapeutic implications［J］.Semin Thromb Hemost，1998，24(1):27 －32.

［7］ Taoka Y，Okajima K，Uchiba M.Antithrombin reduces compression-induced spinal cord injury in rats［J］.J Neurotrauma，2004，21(12):1818－1830.

［8］ Arai M，Goto T，Seichi A，et al.Effects of antithrombinⅢ on spinal cord-evoked potentials and functional recovery after spinal cord injury in rats［J］.Spine，2004，29(4):405 －412.

Protective effects of antithrombinⅢon experimentally secondary spinal cord injury in rats

ZHANG Ping-an1，QI Ya-bin2*(1Dept of Traditional Chinese Medicine Orthopedics，Xi’an Red Cross Hospital，Xi’an 710054，China;2Second Dept of General Surgery，Ninth Hospital of Xi’an;*Corresponding author，E-mail:qiyabin1975@163.com)

ObjectiveTo investigate the protective effects of antithrombinⅢ(ATⅢ)on experimentally secondary injury of spinal cord in rats and its mechanism.MethodsThirty-six Sprague-Dawleys rats were randomly divided into three groups:sham group(n=12)，spinal cord injury(SCI)group(n=12)，ATⅢ treatment group(n=12).Only vertebral lamina excision was performed without SCI in sham group.In the other two groups，the SCI rat models were established according to Allen’s method.Fifteen minutes after SCI，rats in treatment group were intraperitoneally injected with ATⅢ(250 IU/kg)，while those in control group were given normal sodium.The myeloperoxidase(MPO)and superoxide dismutase(SOD)activities and malondialdehyde(MDA)level in spinal tissues were measured at 24 h after operation.Function of nerves was assessed by inclined-plane test and BBB(Basso，Beattie and Bresnahan)scales at 24 h and at 1，2，3 week after operation respectively.ResultsCompared with sham group，the MPO activity and the level of MDA in control group significantly increased(P＜0.01)，and the SOD activity reduced(P＜0.01).Compared with control group，MPO activity and the level of MDA in treatment group decreased and SOD activity increased significantly(P＜0.01).Behavioral score in treatment group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).ConclusionATⅢ has neuroprotective effects on secondary spinal cord injury，which might be associated with the inhibition of neutrophils-mediated immune inflammatory reaction.

spinal cord injury;neutrophils;myeloperoxdase;antithrombinⅢ

R651.2

A

1007 －6611(2011)01 －0015 －03

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.004

張平安，男，1955－03生，本科，副主任醫(yī)師，E-mail:435342755@qq.com.

2010－11－15］