汪 琳 周 琦 柏亞鐸 邢佑尚,2 趙胤澤,2 張鶴曉 蒲 靜 喬彩霞 蔣 迪 齊瑋

(1.北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學;3.博奧生物有限公司)

1 前言

非洲馬瘟[1]是馬科動物的非接觸性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織列為必須檢疫的重大動物疫病。由于該病的巨大破壞性,在國際上進行馬的運輸過程中,尤其是在無 AHS的地區(qū),必須執(zhí)行嚴格的獸醫(yī)衛(wèi)生措施。西尼羅病毒[2]于二十世紀九十年代在歐洲和美洲開始暴發(fā),隨后在西半球不斷蔓延,不僅幾乎傳遍整個美國,而且還進入到加拿大、墨西哥和西印度群島等地區(qū),并成為這些地區(qū)一個重要的公共衛(wèi)生問題。2003年 SARS的出現(xiàn),引起人們對冠狀病毒[3]極大的關注。迄今為止,我國尚未發(fā)現(xiàn)這些病毒感染的臨床病例,但是我國的氣候、地理環(huán)境復雜,蚊蟲種類繁多,具備傳播條件,隨著國際交流的日益頻繁,傳入我國境內(nèi)的可能性非常大。預防病毒意外傳入的第一步是檢測,由于我國目前尚沒有非洲馬瘟、西尼羅熱等病毒的病原體,長期以來一直無法開展針對這些病毒的系統(tǒng)研究,缺乏對這些可能傳入我國的重大傳染病的快速、靈敏和特異的診斷技術,一旦發(fā)生意外傳入和暴發(fā)事件將難以應對。因此很有必要利用現(xiàn)代分子生物學技術,在無病原體的情況下建立非洲馬瘟病毒、西尼羅熱病毒等的檢測方法,為防止這些病毒的傳入和發(fā)生突發(fā)感染事件時迅速排查可疑病例、鑒定病原以及采取有效的預防和控制措施提供技術支撐。

基因芯片技術[4]可將大量已知序列的核酸作為探針固定在玻片等載體上,與互補的核苷酸序列雜交,通過芯片雜交信號,判斷待檢樣品中有無可疑病原體,一次試驗可得出多條信息,具有快速、高通量、并行處理等優(yōu)點,在疾病篩查中具有無可比擬的優(yōu)勢。本研究將芯片技術用于五種馬病檢測中,建立了同時檢測五種馬病病毒的芯片檢測快速篩查技術。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 質(zhì)粒、宿主菌、病毒及血清

原核表達質(zhì)粒 PET-30a、大腸桿菌 (E.coli)BL21(DE3)、馬鼻肺炎病毒和馬動脈炎病毒[5]、待檢血清為北京出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存;非洲馬瘟阻斷 EL ISA試劑盒 (內(nèi)含馬的 AHSV標準陽性血清和陰性血清)購自西班牙 I NGENASA公司;西尼羅病毒購自美國 Fort Dodge Animal Health公司的滅活疫苗;馬冠狀病毒克隆質(zhì)粒引自澳大利亞獸醫(yī)研究所。

2.1.2 引物、探針序列合成與驗證

引物序列:

EAV F-1:TTGTGGTGACGGGATTTTAG EAV R-1::TGTAGCTTGTAGGCTGTCGC

EAV F-2:GGCGACAGCCTACAAGCTAC EAV F-2:CGGCATCTGCAGTGAGTGA

EHVF:ACACGCAGGTCGCTACTAT EHV R:CTCTAGTTGTTTGGCGGTGA

ECV F:CAAACCAGAGGTAGGAGAGC ECV R:GTGCCATACTGGGCTTTAG

WNV F:CACAATGACAAACGTGCTG WNV R:CTTCCTATTGCCTTGGTAGA

AHSV F:GCGATAGCAGCAAGAGCCT AHSV R:GGCCTCATCGATACCGAATGA

每對引物的上游引物的 5’端標記熒光,用于雜交檢測。

探針序列:

EAV orf6:AAATGGACCGAAGACGAGG EAV orf7:TCATAAAGAACCGCTGTACG

EHV-4 gB:CGTTTGTGTAGGCGATGTAG ECV N:ATACCAGCGTGGCAACAAT

WNV: TGTCCACCACTCCTTGTCTG AHSV:ACTCTCGCATCTGTCACTGT

人工合成的AHSV病毒片段:

AHSV-1

GCGATAGCAGCAAGAGCCTTGTCCGTTGTACG GGCATGCGTCACAGTGACAGATGCGAG

AHSV-2

TTGCAATCCCTAACGTCTCCATCACTCCTGGAT CCAAGCTAACTCTCGCATCTGTCACT

AHSV-3

CCTCATCGATACCGAATGATTCGTTAAACCATT GTACCTATTAATTGCAATCCCTAACG

2.1.3 主要試劑及儀器

Cy3-dCTP購自 Amersham Biosciences公司 ;芯片、雜交盒、芯片掃描儀 (Luxscan 10k/B)博奧生物有限公司生產(chǎn),其他化學試劑均為分析純。

2.2 方法

2.2.1 核酸模板制備

本項目中檢測的五種病原體來源不同,擴增模板的制備也不相同。EAV病毒和 EHV-4病毒模板采用MN提取試劑盒提取的 EAV病毒 RNA和EHV-4病毒 DNA;ECV病毒和WNV病毒擴增模板為質(zhì)粒模板;AHSV為人工合成的核酸片段,先用PCR擴增進行連接,擴增后的產(chǎn)物與 T-載體連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化后的菌株進行培養(yǎng)和篩選,篩選出的克隆進行測序驗證,驗證正確的菌株進行質(zhì)粒提取,提取的質(zhì)粒用于 PCR擴增。

2.2.2 多重不對稱 RT-PCR擴增

本項目需要同時檢測馬病的五種病毒,因此建立多重不對稱 RT-PCR擴增體系。實驗中上游熒光標記引物濃度相同,均為 0.2μM,下游引物濃度根據(jù)設定的引物比例進行調(diào)整。整個反應循環(huán)程序分為正常的擴增和高溫退火兩個階段。

2.2.3 芯片上探針點陣排布

芯片上點制 2條陰性對照、3條陽性對照和 5條病毒檢測探針,每條探針設置三個重復。陰性對照是合成的一段植物基因片段,陽性對照為合成的與靶基因沒有同源性的核酸片段,以監(jiān)控雜交反應是否有效。

2.2.4 芯片雜交反應

芯片雜交液組成成分為:10μL雜交緩沖液 +8μL PCR產(chǎn)物,雜交溫度 50℃,雜交時間 2h。雜交后的芯片洗滌后掃描,掃描參數(shù)為:激光 Power 90%,PMT 70%。

2.2.5 芯片特異性和靈敏度實驗

分別提取馬傳染性貧血病毒 (EIAV)、馬腺病毒I型 (EHV-1)、牛鼻氣管炎病毒 (IBRV)、豬胃腸炎病毒 (TGEV)的 RNA,擴增與芯片雜交,驗證芯片檢測體系的特異性。

對建立的檢測體系進行靈敏度評價,實驗方法為:對 AHSV、ECV和WNV質(zhì)粒,EAV和 AHV病毒核酸進行紫外定量,算出濃度 (1A260吸光度值 =ds DNA50mg/mL=ss DNA33mg/mL=ss RNA40mg/mL),根據(jù)病毒的分子量算出病毒的拷貝數(shù),然后對提取的核酸溶液進行 10倍系列稀釋,用稀釋后的核酸溶液做為模板進行多重擴增,擴增后的產(chǎn)物進行芯片雜交,根據(jù)雜交結(jié)果判斷每種病毒的檢測下限。拷貝數(shù)計算公式:(6.02×1023copies/mol)×(濃度 g/mL)/(MW g/mol)=copies/mL。

2.2.6 芯片檢測重復性實驗

按照優(yōu)化好的芯片反應體系,對 5種馬病病毒同時檢測,進行 3個重復實驗,根據(jù)掃描結(jié)果,驗證芯片重復性。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針有效性的驗證

通過實驗篩選雜交信號強,相互無交叉反應的檢測探針,最后篩選出了用于五種病毒檢測的 5條探針,芯片雜交效果見圖 1,用于多重檢測體系的建立。

圖 1 馬病病毒探針驗證結(jié)果

3.2 特異性驗證

分別提取 EI AV、EHV-1、I BRV和 TGEV的RNA,經(jīng) RT-PCR和擴增后分別與芯片進行雜交,掃描結(jié)果顯示,除陽性參照外,其余位點均無雜交信號,說明設計的引物與其他病毒無交叉反應。

圖 2 交叉反應實驗驗證結(jié)果

圖 3 五種病毒混合雜交反應結(jié)果

3.3 芯片檢測體系的建立

通過對引物濃度、多重 PCR反應循環(huán)數(shù)、雜交溫度、雜交時間的優(yōu)化,建立了馬病芯片檢測體系:上下游引物濃度比例為 5:1,第一步 PCR為 25個循環(huán)和第二步 PCR為 15個循環(huán),雜交溫度為 50℃,雜交時間為 2h。五種病毒核酸同時與芯片雜交,無干擾現(xiàn)象都能出雜交信號,見圖 3所示。

3.4 馬病芯片檢測靈敏度評價

對建立的檢測體系進行了靈敏度評價,實驗結(jié)果見圖 4。

圖 4 芯片檢測體系各病毒靈敏度評價

雜交結(jié)果顯示,EAV病毒、ECV質(zhì)粒樣品、WNV質(zhì)粒樣品檢測靈敏度為 102copies;AHSV質(zhì)粒樣品檢測靈敏度為 104copies;EHV-4病毒樣品質(zhì)粒樣品檢測靈敏度為 103copies。

3.5 芯片檢測重復性實驗

圖 5 芯片雜交檢測體系重復性

3.6 進口馬全血樣品的基因芯片篩查

將馬病基因芯片應用于 450份臨床馬血清的篩查,非洲馬瘟、西尼羅熱、馬冠狀病毒全部為陰性,檢出 6份馬動脈炎病毒陽性,2份馬鼻肺炎病毒陽性,與病毒中和試驗結(jié)果一致。

4 討論

基因芯片檢測方法具有快速、靈敏和高通量等特點,可對多個基因位點的信息進行分析,可最大限度保證檢出率。本研究建立的馬病芯片檢測方法,在一次實驗中可同時檢測 5種馬病毒,將檢疫檢疫時間由 1-2周縮短在 7h內(nèi)完成。芯片上設置了芯片表面化學質(zhì)控點、雜交陽性對照點、空白對照點和每種病毒核酸對應的特異核酸探針,并且每條探針點設置 3個平行重復,只有 3個點同時出現(xiàn)信號才判定為有效結(jié)果,有效避免了檢測過程中易出現(xiàn)的假陽性、假陰性現(xiàn)象,對芯片檢測體系的重復性試驗表明所建立的檢測體系具有很好的重復性,芯片批間差異輕微,本研究建立的芯片快速高通量基因芯片檢測方法可應用于大規(guī)模出入境馬屬動物的快速篩查。

[1] BarnardB J H.Circulation ofAfrican horse sickness virus in zebra(Equus burchelli)in the KrugerNational Park,South Africa,as measured by the prevalence of type speci?c antibodies[J].Onderstepoort J Vet Res,1998,60:111-117.

[2] Prowse C V.An ABC for West Nile virus[J].Transfus Med,2003,13(1):1-7.

[3] 郭麗,王健偉,洪濤,等.冠狀病毒分子生物學研究進展 [J].病毒學報,2003,19(4):376-380.

[4] Campas M,KatakisL.DNA biochip arraying,detection and Applicationstrategies[J].Trend in Analysis Chemistry,2004,23(4):40-63.

[5] 朱來華,陸承平,梁成珠,等.馬皰疹病毒 1型 gD基因主要中和抗原區(qū)在大腸埃希氏菌中的表達 [J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(12):929-932.