王彥芳 楊鵬飛 張麗萍 平芮巾 刑福彬 咸慶杰 胡孔新

(1.德州市中心血站 山東德州 253000;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)

1 前言

西尼羅病毒 (West Nile Virus,WNV)屬黃病毒科 (Flaviviridae)、黃病毒屬 (Flavivirus),日本腦炎病毒血清型。該病毒是一種蟲媒病毒,主要以尖音庫蚊[1]傳播為主,以鳥類為主要宿主,可引起人畜共患的自然疫源性疾病。西尼羅病表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛等流感樣癥狀,也可表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀,嚴(yán)重者可死亡,病死率為 5-14%[2-5]。WNV為單股正鏈 RNA病毒[6],基因組全長 10962bp[7],基因組 5′端為結(jié)構(gòu)基因,約占基因組全長 1/4,其余為非結(jié)構(gòu)蛋白基因。病毒基因組 RNA可以直接作為 mRNA,翻譯 3種結(jié)構(gòu)蛋白和 7種非結(jié)構(gòu)蛋白,其排列順序?yàn)镃-pr M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。其中的 NS1蛋白是一種非結(jié)構(gòu)分泌型糖蛋白,在黃病毒蛋白中高度保守[8],它已經(jīng)被證明是黃病毒感染動(dòng)物體內(nèi)的一種可以產(chǎn)生保護(hù)性抗體的有效免疫原[9-12],可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體,無論在疫苗研制還是診斷試劑的開發(fā)上均具有重要的意義[13,14]。本研究用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出西尼羅病毒 WNV FJ151394.1株的 NS1蛋白,并對其免疫原性進(jìn)行了初步研究。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

原核表達(dá)載體 pET30a、宿主菌 DH5α、BL21(DE3)由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所保存。

2.1.2 主要試劑

His-tag Monoclonal Antibody為美國 Novagen公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG系中杉金橋公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG是美國 Sigma公司產(chǎn)品。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

從 Genbank中檢索獲得WNV FJ151394.1株的NS1蛋白基因序列,于其 5’引入 agatctgatg,3’引入caccatcatcatcatcattaataggaattc,送至擎科公司合成。合成的基因全序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶 BglⅡ和 BamHⅠ酶切后與 pET30a連接,得到重組質(zhì)粒 pET30a-WNV-NS1。

2.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)

2.2.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α,小量制備質(zhì)粒后進(jìn)行測序鑒定(測序工作由華大基因公司完成),將鑒定結(jié)果與WNV FJ151394.1株的 NS1蛋白基因序列進(jìn)行比對,未發(fā)現(xiàn)突變。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 BL21(DE3)菌株,于 -80℃保存菌種。

2.2.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)

將含重組質(zhì)粒的工程菌挑單菌落,接種于含卡那霉素 30μg/mL的 LB培養(yǎng)基,37℃搖床過夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)液按 1:50比例接種新鮮的 LB培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng) 2h,測 OD600為 0.579,再加入 IPTG至終濃度為 1mM開始誘導(dǎo) ,37℃培養(yǎng) 3h、4h、5h、6h,分別收獲菌液。

2.2.3 蛋白表達(dá)鑒定

不同誘導(dǎo)時(shí)間的 pET30a-WNV-NS1質(zhì)粒菌液及誘導(dǎo) 6h后含有 pET30a空質(zhì)粒菌液各取 1mL,12000rpm 4℃離心 10min。于離心收集的菌體中加入 20μL去離子水,重懸沉淀,加入 20μL 2×SDS加樣緩沖液裂解后進(jìn)行 SDS-PAGE和Western-Blot分析,Western-Blot一抗使用 1:250稀釋的 Histag Monoclonal Antibody,二抗使用 1:500稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG,使用 DAB避光顯色。

2.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化

根據(jù)小量誘導(dǎo)條件,誘導(dǎo) 1L菌液。8000rpm離心 20min,收獲菌體,超聲裂解,離心后用 8mol/L尿素溶解沉淀,溶解上清過 HisTrapT MHP親和層析柱,采用不同濃度咪唑洗脫,收集有洗脫峰的洗脫液。將洗脫液進(jìn)行脫鹽處理后,過 HiTrapT MDEAE FF弱陰離子交換柱,采用不同鹽離子濃度洗脫,收集有洗脫峰的洗脫液。洗脫液進(jìn)一步在含尿素為 4 M、3 M、2 M、1 M、0.5M的透析緩沖液中透析復(fù)性,最后透析在 PBS中。

2.2.5 重組蛋白多克隆抗體的制備

多抗制備工作由京天成生物技術(shù) (北京)有限公司完成。

2.2.6 EL ISA檢測純化后蛋白抗原性

以重組 WNV NS1蛋白包被 96孔板,1μg/孔,一抗為經(jīng) PBS系列稀釋的兔免疫血清,以 HRP酶標(biāo)的羊抗兔 IgG為二抗,測 A450值。結(jié)果判定方法:被檢血清 OD值與同板陰性對照 OD值之比 ＞2,且被檢血清 OD值大于 0.2者,判為陽性[15,16]。

2.2.7 重組抗原檢測陽性血清

以重組WNV NS1蛋白包被 96孔板,100ng/孔,以 1:10稀釋的免疫兔血清做陽性對照,檢測 FOCUS公司W(wǎng)NV IgG EL ISA試劑盒的陰性血清和陽性血清。

3 結(jié)果

3.1 WNV NS1蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

將鑒定好的重組 pET30a-WNV-NS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 BL21菌 ,經(jīng) IPTG誘導(dǎo) 3h、4h、5h、6h后 ,分別收獲菌液,裂解后進(jìn)行 SDS-PAGE分析,NS1蛋白預(yù)期分子量為 45KD,分析結(jié)果表明 3h、4h、5h、6h均有目的蛋白表達(dá),且在誘導(dǎo) 5h表達(dá)量最大,誘導(dǎo)時(shí)間 6h與誘導(dǎo)時(shí)間 5h相比,未有明顯變化,見圖 1。因此,將 5h定為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖 1 WNV NS1蛋白在大腸桿菌的表達(dá)

3.2 表達(dá)的鑒定:Western-blot檢測WNV NS1

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)Western-blot分析發(fā)現(xiàn),有一條帶可與 His-tag Monoclonal Antibody反應(yīng),形成明顯的反應(yīng)條帶,而 pET30a菌對照則無明顯特異帶出現(xiàn),見圖 2。因?yàn)樵谳d體構(gòu)建時(shí),在目的基因末端加入了 His標(biāo)簽,使得誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白中應(yīng)該含有 His標(biāo)簽,而在Western-blot過程中,一抗使用的是 His-tagMonoclonalAntibody,這種抗體可以與帶有 His標(biāo)簽的蛋白反應(yīng)。因此,可以認(rèn)為,與His-tagMonoclonalAntibody反應(yīng),產(chǎn)生的明顯條帶應(yīng)該就是目的蛋白WNV NS1的條帶。

圖 2 表達(dá)的 WNV NS1蛋白的 Western-blot分析

3.3 原核表達(dá)的WNV NS1蛋白的純化

將大量誘導(dǎo)表達(dá)的 pET30a-WNV-NS1工程菌,經(jīng)包涵體洗脫后,以 His-Binding層析純化后繼以脫鹽實(shí)驗(yàn)和陰離子交換層析 (WNV NS1蛋白等電點(diǎn)約為 8.9),結(jié)果見圖 3。

圖 3 蛋白純化結(jié)果

3.4 重組蛋白免疫血清的鑒定

包被 WNV NS1重組抗原,1μg/孔,一抗使用不同稀釋度的免疫血清,二抗使用 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,經(jīng) T MB顯色 20min后,用 2M H2SO4終止染色,在波長為 450nm下測量各孔 OD值。

根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)本 (S)和陰性對照 (N)的值之比,即 S/N＞2時(shí)判為陽性[15,16],在這種半定量測定中,將待測血清做一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn),呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)稀釋梯度的檢測結(jié)果見表 1。從表 1中可以看出,將待測血清 1:50000稀釋,在 450nm波長下測得的OD值為 0.440,陰性對照為 0.205,S/N＞2,因此認(rèn)為 1:50000稀釋后的待測血清檢測結(jié)果可以定為陽性,而將待測血清 1:100000稀釋后,在 450nm波長下測得的OD值為 0.294,S/N＜2,1:50000稀釋后的待測血清檢測結(jié)果可以定為陰性。綜上,可以認(rèn)為,免疫血清的效價(jià)為 1:50000。

表 1 檢測免疫血清效價(jià)的 EL ISA結(jié)果

3.5 重組抗原檢測陽性血清結(jié)果

以重組WNV NS1蛋白包被 96孔板,100ng/孔,檢測 FOCUS公司W(wǎng)NV IgG EL ISA試劑盒的陰性血清和陽性血清。陰陽性血清均是 1:1000稀釋,測得OD450吸光值分別為:陰性血清 0.39,陽性血清 0.834,P/N為 2.14,結(jié)果判為陽性,即以重組蛋白 WNV NS1做為抗原,將待測血清 1:1000稀釋,可以檢測出WNV感染的陽性血清。

4 討論

正是因?yàn)辄S病毒科 NS1蛋白可以刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[9-12],所以近幾年,國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)NS1蛋白的抗原性,建立了檢測黃病毒感染的免疫學(xué)檢測方法,如 Eiji Konishi等[17-18]學(xué)者于2002年和 2004年均以純化的日本腦炎病毒 NS1蛋白為基礎(chǔ),分別建立了檢測日本腦炎病毒感染的免疫染色法和間接 EL ISA法。基于此,筆者認(rèn)為,同樣屬于黃病毒科的西尼羅病毒的 NS1蛋白也可以作為有效的抗原,用于對西尼羅病毒檢測的診斷試劑的研究。

因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是成本較低,可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量蛋白,因此本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌 pET表達(dá)系統(tǒng)。pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng),pET載體中,目的基因受噬菌體 T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制,并受宿主細(xì)胞提供的 T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)表達(dá),得到充分誘導(dǎo)后可以高水平表達(dá)目的蛋白。但是即使在沒有 IPTG等誘導(dǎo)劑存在的情況下,也會有 lacUV5啟動(dòng)子表達(dá)的 T7 RNA聚合酶,從而存在目的蛋白的本底表達(dá)。所以本實(shí)驗(yàn)在做蛋白電泳檢測目的蛋白表達(dá)情況時(shí)使用的陰性對照是誘導(dǎo)后的 pET30a空質(zhì)粒菌液,而沒有使用加入 IPTG誘導(dǎo)前重組質(zhì)粒菌液。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也存在不易克服的缺點(diǎn):如有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,在一定時(shí)間內(nèi),目的蛋白的產(chǎn)量與誘導(dǎo)時(shí)間成正相關(guān),但較長的時(shí)間由于這種細(xì)胞毒作用,反而會使目的蛋白的產(chǎn)量下降。為使目的蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最大,本實(shí)驗(yàn)在小量誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間,結(jié)果證明在 5h內(nèi),蛋白產(chǎn)量與誘導(dǎo)時(shí)間呈正比,第 5h與第 6h產(chǎn)量幾乎無差別,故將 5h做為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

His標(biāo)簽是常用的純化蛋白的融合標(biāo)簽,特別是那些以包涵體形式表達(dá)的蛋白,它可以將蛋白在完全變性的條件下溶解,繼而進(jìn)行親和純化。為了使獲得的蛋白溶液純度更高,本實(shí)驗(yàn)在親和層析后進(jìn)行了離子交換層析,獲得了純度相對較高的目的蛋白溶液。

本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對 WNV NS1蛋白進(jìn)行表達(dá),經(jīng) western blot檢測證明獲得了帶有 His標(biāo)簽的WNV NS1蛋白,通過對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析和陰離子交換層析獲得了較純的目的蛋白,用蛋白免疫的兔血清經(jīng)間接 EL ISA檢測證實(shí)了獲得的 NS1蛋白具有免疫原性,可以用于 WNV感染血清的檢測。

目前我國境內(nèi)雖然尚未有西尼羅病毒感染病例的報(bào)道,但是隨著候鳥的遷徙,國際交流的日益頻繁,WNV的入境機(jī)會可能會大大增加,因此我們應(yīng)該未雨綢繆,為WNV的傳入與出現(xiàn)進(jìn)行必要的技術(shù)儲備,WNV NS1蛋白的成功表達(dá)為進(jìn)一步研制診斷試劑以及深入研究 NS1蛋白的結(jié)構(gòu)功能等奠定了基礎(chǔ)。

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