周成勇，張寶秀

（長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011）

N1，N5-二（1-甲基咪唑 -2-?；┒一返暮铣膳c表征

周成勇，張寶秀

（長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011）

文章首次報道了一種含咪唑環(huán)多胺類化合物N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺的合成方法，以此化合物為基礎(chǔ)，可以合成對稱平行的發(fā)卡式多酰胺分子，以期對DNA序列進(jìn)行新的特異性識別，從而開發(fā)研制新型有效的工具酶或抗癌藥物。合成方法簡便易行、耗時短、不需要過柱分離，每一步合成都有較高的產(chǎn)率。

咪唑；二乙基三胺；多胺；化學(xué)核酸酶

1 引言

核酸斷裂與基因重組技術(shù)是分子生物學(xué)和基因工程的核心技術(shù)，其中DNA、RNA的定位斷裂又是該技術(shù)的關(guān)鍵。限制性內(nèi)切酶能在特定位點切割DNA分子，但其識別位點僅為4～8個核苷酸，且只能在數(shù)目有限的位點斷裂DNA，給基因工程技術(shù)帶來一定限制?；瘜W(xué)合成的DNA、RNA定位斷裂工具是國際上在二十世紀(jì)八十年代興起的一類新型非酶斷裂工具，稱為化學(xué)核酸酶（chemical nucleases）。它們既具有限制性內(nèi)切酶的高度專一性，又能在人們預(yù)先設(shè)計的任何位點斷裂DNA和RNA，且制備簡便、價格便宜、不受酶的天然專一性限制，在新型抗腫瘤、抗愛滋病化學(xué)藥物的定向設(shè)計及其基因治療，基因工程研究中基因分離、大片段基因序列分析，染色體圖譜分析及DNA定位誘變，分子印記技術(shù)（footprinting），DNA的構(gòu)象識別等方面均有重要意義和應(yīng)用前景[1，2]。隨著遺傳工程及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們越來越不滿足于限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用，化學(xué)合成的核酸斷裂工具越來越引起人們的重視。

化學(xué)核酸酶從結(jié)構(gòu)上大致分為兩部分。一是DNA識別結(jié)合系統(tǒng)。在生物體內(nèi)DNA序列的特異性識別常通過蛋白質(zhì)與DNA的相互作用實現(xiàn)。但由于蛋白質(zhì)分子具有量大、含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且容易變性等特點，研究起來十分困難，因而尋找新的簡單有效的方法來特異性識別DNA序列，實現(xiàn)有目的的基因調(diào)控就具有十分重要的意義。目前用于識別DNA序列的非生物分子主要有寡聚核苷酸、寡聚核苷酸類似物——多肽核酸（PNA）[3]、多胺類化合物等。特別是多胺類化合物的研究，在美國加州理工大學(xué)Dervan教授的帶領(lǐng)下，近些年來取得了令人矚目的成果。迄今為止，科學(xué)家們成功地合成了一系列各種結(jié)構(gòu)的、對DNA具有特異性識別功能的多胺分子?？s聚單體除N-甲基吡咯（Py）外，還有N-甲基咪唑（Im）、N-甲基-3-羥基吡咯（Hp）、噻唑、呋喃、苯環(huán)、嘧啶、嘌呤等[4-7]。結(jié)構(gòu)形式有鏈狀、發(fā)卡式、環(huán)狀等[8-13]。不同結(jié)構(gòu)的多酰胺分子可識別不同的堿基對，根據(jù)Dervan總結(jié)的規(guī)則：Py/Im對C·G堿基對（C：cytosine胞嘧啶，G:guanine鳥嘌呤）進(jìn)行識別，Im/Py識別G·C堿基對，Py/Py識別 A·T和 T·A堿基對（A：ademine腺嘌呤，T:thymine胸腺嘧啶），Py/Hp識別A·T堿基對，Hp/Py識別T·A堿基對[9]。二是DNA的切割系統(tǒng)。DNA的切割從斷裂機(jī)理上可分為光切割、氧化切割和水解切割。（1）光切割是指切割試劑在光照下產(chǎn)生自由基使DNA發(fā)生斷裂。（2）氧化切割是指金屬配合物在雙氧水或分子氧存在的情況下，由還原劑活化導(dǎo)致核酸中戊糖環(huán)的斷裂，斷裂產(chǎn)物不能被重新克隆。（3）水解切割是指斷裂試劑使DNA骨架中的磷酸二酯鍵發(fā)生水解斷裂，并不破壞戊糖環(huán)，斷裂產(chǎn)物可被重新克隆。無論是氧化切割還是光切割，對DNA既無選擇性，斷裂產(chǎn)物也不能用連接酶進(jìn)行連接，而且氧化切割還以破壞戊糖環(huán)為代價；而DNA的水解切割反應(yīng)條件溫和，可在近生理條件下進(jìn)行，且斷裂產(chǎn)物可用連接酶進(jìn)行重新連接。因此發(fā)展高效、選擇性強(qiáng)、能有效水解斷裂核酸中磷酸二酯鍵的化學(xué)核酸酶具有非常之意義。

楊頻教授[14]等曾利用主族元素Mg為中心的雙核金屬配合物[Mg2（dien）Cl（OH）]Cl2·2H2O（dien：二乙基三胺）在近生理條件、不加任何其它外來物質(zhì)的情況下，對PBR322DNA實現(xiàn)了有效切割。加入H2O2、還原劑（如DTT，抗壞血酸）及羥基自由基驅(qū)除劑（如DMSO，丙三醇）對反應(yīng)基本無影響；無氧條件下仍可高效切割DNA。斷裂產(chǎn)物線形DNA可被T4連接酶有效連接。這都證明該斷裂是由于DNA磷酸骨架水解所致[14]。因此，本文選擇Im/Im作為DNA的識別系統(tǒng)；選擇二乙基三胺作為水解切割DNA的功能基，然后將其與DNA的識別系統(tǒng)進(jìn)行連接，合成了一種對稱平行的多胺分子-N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-?；┒一?，以期對DNA序列進(jìn)行新的定位切割，從而研制新型有效的化學(xué)核酸梅和抗癌藥物。

2 實驗部分

2.1 主要實驗儀器和試劑

（1）熔點測定：數(shù)字式熔點儀（上海物理光學(xué)儀器廠）。

（2）1H NMR與13C NMR譜：DRX300MH超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士BRUKER公司）；采用5mm核磁管，TMS為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)位移以ppm表示，吸收峰的多重性以 s，d，t，q，b 分別表示單峰、雙峰、三重峰、多重峰和寬峰。

（3）IR譜：PERKIN-ELMER-983型傅立葉變換紅外儀（日本島津）；攝譜范圍4000-450 cm-1，分辨率4 cm-1，KBr壓片。吸收峰位置以cm-1為單位，強(qiáng)度以vs，s，m，w分別表示非常強(qiáng)、強(qiáng)、中強(qiáng)和弱。

（4）元素分析：VARI-EL型元素分析儀（德國EA元素分析系統(tǒng)公司），測定C、H、N。

（5）質(zhì)譜測定：Themofinnigan Polaris質(zhì)譜儀。

N-甲基咪唑購自于美國Sigma-Aldrich公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2.2 合成路線

合成路線如圖1所示。

圖1 化合物N 1，N 5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺的合成路線Fig.1 Thesynthetic routeofthe compound N1，N5-bis（1-methylimidazole-2-carbonyl）diethylenetriamine.（i）DMF，100 ℃；（ii）anhydrousethylether；（iii）DMF，0℃.

2.3 實驗步驟

2.3.1 三氯乙酰氯的合成

三氯乙酰氯按照文獻(xiàn)[15]合成。將 300 g（1.8mol）三氯乙酸、10mlDMF和135ml（1.85 mol）二氯亞砜混合，加熱回流2小時。蒸餾除去二氯亞砜，收集116～117.5℃的餾分。得到321.9 g產(chǎn)品（淡黃色透明液體）。產(chǎn)率96.4%。b.p.116～117.5℃。

2.3.2 N-甲基-2-三氯乙酰基咪唑的合成

在攪拌下將N-甲基咪唑（4.103 g，0.05 mol）的無水乙醚溶液在2小時內(nèi)滴加入到三氯乙酰氯（9.09 g，0.05 mol）的無水乙醚溶液中，繼續(xù)攪拌2小時。將4 g碳酸鉀溶于15ml水中的溶液滴加到反應(yīng)混合物中終止反應(yīng)。分液后將醚層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到10.52 g產(chǎn)品（淡黃色固體）。產(chǎn)率93.1%。m.p.95-96 ℃；1H NMR （CDCl3）：7.48（d，J=1.7 Hz，1H），6.98（d，J=1.7 Hz，1H），3.67（s，3H）。13CNMR（CDCl3）：187.6，153.8，135.7，123.5，94.0，29.8。

2.3.3 N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-?；┒一返暮铣?/h4>

將化合物N-甲基-2-三氯乙?；溥颍?.8035 g，7.93 mmol）溶于 50 mLDMF，冰水冷卻下攪拌20 min，將溶于10 mLDMF的二乙基三胺（0.4083 g，3.97 mmol）溶液滴加到上述溶液中，立即有黃色沉淀生成。冰水冷卻下繼續(xù)攪拌2 h，溫度升至室溫再攪拌2 h，停止反應(yīng)。將反應(yīng)混合液過濾，固體用THF、無水乙醚洗滌，真空干燥，所得固體再用熱THF重結(jié)晶，得黃色固體。m.p.152.4-153.2℃。Anal.Calc.for C14H21N7O2：C，52.65；N，30.70;H，6.63。Found:C，52.62；N，30.68；H，6.65。1H NMR（300MHz，DMSO-d6δ，ppm）：8.02（t，J=1.65Hz，2H，H6），7.64（d，J=5.76Hz，2H，H3），7.18（d，J=1.92Hz，2H，H4），3.65（s，6H，H1），3.12（t，J=6.32Hz，4H，H7），2.85（m，J=7.08Hz，4H，H8），2.09 （s，1H，H9）。13CNMR （300MHz，DMSO-d6，δ，ppm），C5 158.2，C2 154.8，C3 137.1，C4 124.4，C8 48.6，C7 39.6，C1 29.1。IR （KBr）: ν（N-H）3419.6，ν（N-H）3249.8，ν（Im C-H）3105.2，ν（C-H）2985.6，ν（C-H）2904.6，ν（C=O）1587.3，ν （N-H）1562.2，ν （C=C）1490.9，ν（N-CH3 N-C）1469.7，ν（C-N）1338.5，ν（C-N）1311.5，ν （C-N）1223.6，ν （C-N）1130.2，ν（C-C）1064.9，ν（C-C）1014.5，ν（C-H）972.1，ν（C-H）896.8，ν（C-H）867.9，ν（Im C-H）781.1。HRMS:calculated forC14H21N7O2319.18；found 319.16。

3 結(jié)果與討論

在合成過程中，考慮到二乙基三胺的結(jié)構(gòu)對稱性，我們選擇了在其兩端連接咪唑環(huán)的方案，合成了一種對稱平行的多胺分子N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺。整個合成過程所采取的方法簡便易行，不需過柱分離，每步合成都有較高產(chǎn)率。在此化合物基礎(chǔ)上，還可繼續(xù)連接其它不同的DNA識別基團(tuán)，從而可合成一系列DNA定位切割劑，對DNA的不同位點進(jìn)行定位切割。

在制備1-甲基-2-三氯乙?；溥虻倪^程中，發(fā)現(xiàn)此固體在空氣中不穩(wěn)定，很容易吸水潮解。因此，得到的固體應(yīng)在真空干燥器中放入干燥劑真空保存，或者得到該固體后立即進(jìn)行下一步的反應(yīng)。

正常N-甲基咪唑環(huán)上的H3和H4在H1-NMR譜中的化學(xué)位移應(yīng)在7.00和6.88左右，但在目標(biāo)化合物中咪唑環(huán)上連有吸電基團(tuán)HN-CO-，通過共軛效應(yīng)和誘導(dǎo)效應(yīng)使得其質(zhì)子周圍的電子云密度降低，對外加磁場的屏蔽效應(yīng)減弱，所以其化學(xué)位移向低場移動，實際測得為7.64和7.18。而咪唑環(huán)上N-CH3上的質(zhì)子（H1），由于與吸電基團(tuán)HN-CO-相距較遠(yuǎn)，則受其影響不大。

標(biāo)題化合物與DNA的作用及其生物功能，尚待進(jìn)一步研究。

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Synthesis and Characterization of N1,N5-Bis（1-methylim idazole-2-carbonyl）Diethylenetriam ine

ZHOU Cheng-Yong，ZHANG Bao-xiu
（Department of Chemistry，Changzhi University，Changzhi Shanxi 046011）

In this paper,the synthesis of a sort of symmetrical and parallel polyamide，N1，N5-Bis（1-methylimidazole-2-carbonyl）diethylenetriamine，was reported first.The whole process was also simple and convenientwithout column chromatography with high yields.The target compound was anticipated to recognize DNA sequence specifically and cleave itat predetermined site.

imidazole；diethylenetriamine；polyamide；chemical nuclease

O62

A

1673-2014（2011）02-0001-04

2010—10—18

山西省高?？萍奸_發(fā)項目資助課題（№：2007154）

周成勇（1963— ），男，河南省沁陽市人，博士，教授，主要從事有機(jī)合成和生物無機(jī)化學(xué)方面的研究。

（責(zé)任編輯 王璟琳）