佘小漫, 何自福, 李華平, 虞 皓

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣州 510640; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,廣州 510642)

茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum(Smith)Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病原細(xì)菌之一,廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。該病原細(xì)菌的寄主范圍很廣,可侵染55科數(shù)百種植物[1]。在我國(guó),目前已報(bào)道有番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、煙草、花生、生姜、沙姜、桑、空心菜和桉樹(shù)等 10余種作物受到該病原細(xì)菌的危害。

茄科雷爾氏菌種內(nèi)存在明顯生理分化和遺傳差異。根據(jù)對(duì)不同寄主植物種類(lèi)的致病性不同,將該病原細(xì)菌其劃分為5個(gè)生理小種(race)[2-4];而根據(jù)菌株對(duì)3種二糖和3種己醇氧化能力的差異,又可以將其劃分為6個(gè)生化變種(biovar)[3,5-6]。Li等[7]通過(guò)對(duì)16Sr RNA基因序列分析將茄科雷爾氏菌分為2個(gè)簇(或亞種),并與 Cook等[8]的 2個(gè)區(qū)組(division)相對(duì)應(yīng)。另外,分子系統(tǒng)進(jìn)化分析還可以將該病原細(xì)菌區(qū)分為亞洲組(Asiaticum)、美洲組(Americanum)和非洲亞組(African subdivision)等3個(gè)地理組[9-11]。因此,分類(lèi)意義上的茄科雷爾氏菌明顯是一個(gè)復(fù)合種。

對(duì)于茄科雷爾氏菌這個(gè)復(fù)合種,不同來(lái)源,尤其是不同寄主植物來(lái)源的菌株間系統(tǒng)進(jìn)化在分子水平上有無(wú)差異?先前的研究結(jié)果顯示,不同地理區(qū)域和寄主植物來(lái)源的茄科雷爾氏菌菌株存在豐富的遺傳多樣性[12-13],但其16S rDNA十分保守[14]。在茄科雷爾氏菌的分類(lèi)與系統(tǒng)進(jìn)化研究時(shí),16S-23S rDNA ITS序列分析可以作為16S rDNA序列分析的補(bǔ)充[15]。因此,本文通過(guò)對(duì)來(lái)源于12種寄主植物的茄科雷爾氏菌代表菌株的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的研究,進(jìn)一步探討這些不同寄主來(lái)源菌株的分子特征,全面認(rèn)識(shí)該病原菌的生理分化和遺傳變異,為控制該病原菌的危害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共21株,分別分離自廣東不同寄主植物,并鑒定其所屬生化變種[16](表1)。所有菌株均在含2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3 d。選取白邊寬中間粉紅色的單菌落用于試驗(yàn)。

表1 供試的21個(gè)茄科雷爾氏菌菌株

1.2 菌株基因組DNA的提取

按Boucher等[17]方法提取各菌株基因組DNA。

1.3 PCR引物

用原核生物16S-23S rDNA ITS通用引物[18]進(jìn)行 PCR,其序列為:1493f(5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′)和 23r(5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′)。上述引物均由上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL)含如下成分:DNA模板約 20～25 ng,10×PCR buffer 2.5μL,dNTPs 200μmol/L,2個(gè)引物各0.4μmol/L和3 U Taq酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性4 min,之后94℃變性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán),72℃最終延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取6μL擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司)觀(guān)察和分析電泳結(jié)果。

1.5 序列分析

對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的茄科雷爾氏菌21個(gè)株菌16S-23SrDNA ITS進(jìn)行雙向測(cè)序,以獲得各菌株全序列,并將這些序列分別與19個(gè)茄科雷爾氏菌菌株、2個(gè) blood disease bacterium(BDB)菌株(表 2)的16S-23S rDNA ITS進(jìn)行比較分析,應(yīng)用DNAstar 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表2 參與分析的茄科雷爾氏菌和BDB菌株及其16S-23Sr DNA ITS序列1)

2 結(jié)果分析

2.1 PCR擴(kuò)增16S-23Sr DNA ITS序列結(jié)果

應(yīng)用原核生物通用引物23r和1 493f分別對(duì)21個(gè)茄科雷爾氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,從21個(gè)菌株基因組DNA中均能成功地?cái)U(kuò)增出約590 bp特異片段,與預(yù)期片段大小一致(圖 1)。

圖1 PCR擴(kuò)增21個(gè)菌株16S-23Sr DNA ITS的產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 16S-23SrDNA ITS序列分析結(jié)果

對(duì)21個(gè)菌株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,結(jié)果表明:除菌株HZ-1擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為586 bp(GenBank登錄號(hào):FJ744134)外,其他20個(gè)菌株擴(kuò)增的片段大小均為591 bp(GenBank登錄號(hào)見(jiàn)圖2)。去除兩端16S rDNA和23 rDNA序列,菌株HZ-1的ITS序列長(zhǎng)度為498 bp,其他20個(gè)菌株的ITS序列全長(zhǎng)均為503 bp。

序列比較結(jié)果顯示,21個(gè)菌株之間ITS序列相似性最高為100%,最低為95.4%;菌株HZ-1與R.solanacearum GMI1000的16S-23SrDNA ITS序列相似性為 95.8%,而其他 20個(gè)菌株序列與 R.solanacearum GMI1000的16S-23SrDNA ITS序列相似性均大于99.2%(表3)。進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn),菌株HZ-1與其他20個(gè)菌株分別有33～37 bp不等的堿基差異;在其余20個(gè)菌株中,菌株 DG-2、HZ-2、GY-2 、RR-1 、RR-2 、NX-1 、NX-5 、PY-10 、GY0501 和FC-1 之間 ,菌株 GY-1、LZ-3、YC-33 、ZCZ-2、MA 和PC之間,以及菌株 YC-5、CW-1和CW-10之間,其ITS序列均完全一致,其余菌株間也僅有1～4個(gè)不等的堿基差異。

根據(jù)21個(gè)菌株以及來(lái)源于GenBank的22個(gè)菌株(包括 P.pickettii外圍菌株)16S-23S rDNA ITS,利用DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果顯示:40個(gè)茄科雷爾氏菌株、2個(gè)BDB菌株共42個(gè)菌株可聚類(lèi)為3個(gè)分支,其中第1分支包含了生化變種Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ菌株,對(duì)應(yīng)于Li等[7]的茄科雷爾氏菌區(qū)組1;第2分支包含了生化變種Ⅰ和Ⅱ菌株,對(duì)應(yīng)于Li等[7]的茄科雷爾氏菌區(qū)組2;兩個(gè)BDB菌株自成一個(gè)分支。本研究的21個(gè)菌株中,只有菌株HZ-1聚類(lèi)在區(qū)組2,其余20個(gè)菌株聚類(lèi)在區(qū)組 1(圖 2)。

表3 21株茄科雷爾氏菌16S-23S rDNA ITS的序列相似性比較 %

續(xù)表3%

圖2 茄科雷爾氏菌及相關(guān)菌株的16S-23Sr DNA ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

16S-23S rDNA ITS序列的進(jìn)化速度是16S rDNA的10倍[19],該區(qū)間經(jīng)常有序列的缺失和插入,造成不同種和同種不同菌株的16S-23S rDNA ITS在數(shù)目、長(zhǎng)度和序列組成上的異質(zhì)性。因此,在細(xì)菌分類(lèi)、系統(tǒng)進(jìn)化和分子特征等研究中,16S-23S rDNA ITS序列分析具有重要價(jià)值。

本研究分析了來(lái)源于12種寄主植物21株茄科雷爾氏菌的16S-23S rDNA ITS全長(zhǎng)序列,除菌株HZ-1外,其余20個(gè)菌株的序列長(zhǎng)均為503 bp,序列間相似性為99.2%～100%;而HZ-1菌株的序列長(zhǎng)為498 bp,與其他 20個(gè)菌株間的序列相似性為95.4%～95.6%。所有菌株 ITS序列所包含的tRNAala和 tRNAile核苷酸序列完全一樣,高度保守。因此,來(lái)源于不同寄主植物的茄科雷爾氏菌菌株間的16S-23S rDNA ITS序列也十分保守。

本研究21個(gè)菌株中,僅HZ-1菌株屬生化變種Ⅱ,并與已登錄GenBank的茄科雷爾氏菌生化變種Ⅰ、Ⅱ菌株聚類(lèi)在區(qū)組2分支中;而其余20個(gè)菌株分別屬生化變種Ⅲ和Ⅳ,且與已登錄GenBank的茄科雷爾氏菌生化變種Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ各菌株聚類(lèi)在區(qū)組1分支中。由此可見(jiàn),茄科雷爾氏菌的生化變種與區(qū)組間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。這與對(duì)16S rDNA分析結(jié)果一致[16]。茄科雷爾氏菌種內(nèi)以及一些關(guān)系密切的相關(guān)菌如 blood disease bacterium(BDB)的 16S rRNA基因的序列高度相似,有時(shí)也難以區(qū)分[8-9]。但利用ITS序列,BDB菌自成一個(gè)分支,可以將其與茄科雷爾氏菌分開(kāi)。

對(duì)于分離自廣東惠州馬鈴薯上的茄科雷爾氏菌菌株 HZ-1,其16S-23S rDNA ITS與 HZ-2及其他茄科雷爾氏菌菌株均存在較大差異,推測(cè)該菌株與其他20個(gè)菌株的起源不同。16S-23S rDNA ITS系統(tǒng)進(jìn)化分析也支持這一推測(cè),即HZ-1菌株屬于茄科雷爾氏菌區(qū)組2,而其他20個(gè)菌株均屬于茄科雷爾氏菌區(qū)組1。但該菌株的真正起源及與其他菌株間致病性差異等還有待于進(jìn)一步研究。

[1] Hayward A C.Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J].Annual Review Phytopathology,1991,29:65-87.

[2] Buddenhgen I,Sequeira L,Kelman A.Designation of races in Pseudomonassolanacearum[J].Phytopathology,1962,52:726.

[3] He L Y,Sequeira L,Kelman A.Characteristics of strains of Pseudomonassolanacearum[J].Plant Dis,1983,67:1357-1361.

[4] Pegg K,Moffett M.Host range of the ginger strain of Pseudomonas solanacear um in Queensland[J].Aust J Ex p Agric Anim Husb,1971,11:696-698.

[5] Hayward A C.Characteristics of Pseudomonassolanacearum[J].Journal of Applied Bacteriology,1964,27:265-277.

[6] Hayward A C,El-Nashaar H M,Nydegger U,et al.Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacear um[J].J Appl Bacteriol,1990,69:269-280.

[7] Li X,Dorsch M,Del Dot T,et al.Phylogenetic studies of the rRNA group II pseudomonads based on 16S r RNA gene sequences[J].Journal of Applied Bacteriology,1993,74:324-329.

[8] Cook D,Barlow E,Sequeira L.Genetic diversity of Pseud omonas solanacear um:detection of restriction fragment length polymorphisms that specify virulence and the hypersensitive response[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1989,2:113-121.

[9] Cook D,Barlow E,Sequeira L.Genetic diversity of Pseud omonas solanacear um:detection of restriction fragment length polymorphisms that specify virulence and the hypersensitive response[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1989,2:113-121.

[10]Taghavi M,Hayward A C,Lindsay I et al.Analysis of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum,Pseudomonas syzy gii,and the blood disease bacterium of banana based on 16S r RNA gene sequence[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1996,46:10-15

[11]Poussier S,Trigalet-Demery D,Vandewalle P,et al.Genetic diversity of Ralstonia solanacear um as assessed by PCR-RFLP of the hr p gene region,AFLPand 16S r RNA sequence analysis and identification of an African subdivision[J].Microbiology,2000,146:1679-1692.

[12]何自福,虞皓,羅方芳.廣東茄科青枯菌致病力分化及其 DNA多態(tài)性分析[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(5):415-420.

[13]陳永芳,何禮遠(yuǎn),等.我國(guó)植物青枯菌菌株的遺傳多樣性和組群劃分[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(6):503-508.

[14]佘小漫,何自福,虞皓,等.廣東茄科雷爾氏菌16S r DNA序列分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(4):24-28.

[15]Pastrik K H,Elphinstone J G,Pukall R.Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacear um by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control[J].European Journal of Plant Pathology,2002,108:831-842

[16]佘小漫,何自福,李華平,等.廣東茄科雷爾氏菌菌株生化變種的測(cè)定[G]∥中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2008:337-339.

[17]Boucher C A,Van Gijsegem F,Barberis P A,et al.Pseud omonas solanacear um genes controlling both pathogenicity on tomato and hy persensitivity on tobacco are clustered[J].Journal Bacteriology,1987,169:5626-5632.

[18] Li Xiang,De Boer SH.Selection of polymerase chain reaction primers from an RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus[J].Phytopathology,1995,85:837-842.

[19]鄭雪松,楊虹,李道棠,等.基因間隔序列(ITS)在細(xì)菌分類(lèi)鑒定和種群分析中的應(yīng)用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2003,9(6):678-684.