高 飛, 高 利, 劉太國, 高繼國, 陳萬權(quán)*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193)

RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerases)在基因表達的過程中扮演著很重要的角色。早在1984年以前,生物化學(xué)家就已經(jīng)在真核生物中成功地分離出3種RNA聚合酶[1]。其中,RNA聚合酶II由12個亞基組成(RPB1～RPB12),負責(zé)轉(zhuǎn)錄生成hnRNA和 mRNA[2]。RPB2(the second largest RNA polymerase subunit)基因負責(zé)編碼RNA聚合酶II的第2大亞基,具有單拷貝和進化速率慢的特點[3]。RPB2基因片段與其他不同基因片段如ITS(internal transcribed spacer)、RPB1 、EF(elongation factor)等相結(jié)合,目前已廣泛地應(yīng)用于真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究[4-6]。

小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn,簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害,對小麥生產(chǎn)造成嚴重的危害[7-8],也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一[9]。與其近緣的小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌也是引起小麥病害的重要病原菌。3種真菌在形態(tài)學(xué)上極為相似,難以區(qū)別。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,從分子水平上尋找三者的差異成為植病學(xué)者研究的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

小麥矮腥黑粉菌共12個菌株分別來源于美國(11個)、捷克(1個),小麥光腥黑粉菌(T.laevis Kühn,簡稱 TLK)共 6個菌株,除 1個來自捷克外,其余來自國內(nèi)不同地區(qū),均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所麥病組收存;小麥網(wǎng)腥黑粉菌[T.caries(DC.)Tul.,簡稱 TCT]共8個菌株,除1個來自捷克外,其余由重慶大學(xué)王中康教授提供。此外,還選用了相近的其他6種真菌(見表1)。

表1 供試菌株及來源

1.1.2 試劑與儀器

Taq DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技公司;克隆載體p MD18-T、IPTG、X-Gal購于寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠試劑盒購于Axygen公司;試驗中涉及的引物及設(shè)計的特異引物由上海生物工程公司合成。高速冷凍離心機(Sigma)、紫外分光光度計(Nano Drop)、PCR儀(MJ Research)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)等儀器由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所麥病組配備。

1.2 基因組DNA的提取

采用改良的SDS法提取基因組DNA[10],DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用Nano Drop公司生產(chǎn)的紫外分光光度計檢測各個菌系DNA濃度與純度。

1.3 RPB2基因片段的擴增

擴增RPB2基因片段的引物為RPB2-740F/RPB2-1365R(RPB2-740F:GATGGACGCGGTTTGTAATG;RPB2-1365R:TCGAAGAGCYAACACTGAGACG)[6]。擴增程序為:94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃10 min。

PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包含:10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+(25 mmol/L)2 μL 、dNTPs(10 mmol/L)0.3μL、Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.3 μL、引物(10 μmol/L)各 1 μL 、DNA 模板(20 ng/μL)1μL、用滅菌雙蒸水補足25μL。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測序

將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,電泳后在紫外燈下將擴增的條帶切下,用DNA回收試劑盒進行純化(Axygen公司)。純化后的產(chǎn)物連接到載體pMD18-T上(TaKaRa公司),轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。通過藍白斑篩選,挑取白色菌落經(jīng)過菌液PCR及質(zhì)粒酶切鑒定陽性克隆子后,交由上海生物工程公司測序。

1.5 序列分析及比對

將3種小麥腥黑粉菌的RPB2基因片段的序列用DNAMAN軟件進行分析,比對它們之間的序列差異,并將3種小麥腥黑粉序列片段在GenBank上進行同源序列比較。

1.6 將RPB2通用引物作為TCK特異引物的內(nèi)置對照引物擴增

以RPB2的通用引物作為小麥腥黑粉菌屬的內(nèi)置對照引物與小麥矮腥黑粉菌特異性引物CQUTCK2/CQUTCK3(CQUTCK2:TCTAACTTACCTCGCGGATGG;CQUTCK3:ACGCAGTGACGGGTGGATA)[11]相結(jié)合進行共同擴增。擴增程序為:94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃10 min。

PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包含:10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+(25 mmol/L)2 μL 、d NTPs(10 mmol/L)0.3μL、Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.3 μL、引物 CQUTCK2/CQUTCK3,RPB2-740F/RPB2-1365R(10 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板(20 ng/μL)1μL、用滅菌雙蒸水補足25μL。

2 結(jié)果

2.1 RPB2基因片段的擴增結(jié)果

對3種小麥腥黑粉菌的不同菌株及相近的3個屬的6種真菌進行PCR擴增,小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌均能擴增出一條大約600 bp的條帶,而與小麥腥黑粉菌相近的其他6種真菌均沒有擴增產(chǎn)物(圖1)。說明該通用引物可以作為小麥腥黑粉菌的特異性引物區(qū)分與其近似的其他黑粉菌。

圖1 RPB2基因引物RPB2-740F/RPB2-1365R對不同真菌基因組DNA的PCR擴增

2.2 RPB2基因片段的測序結(jié)果

測序結(jié)果表明,小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌擴增的 RPB2基因片段大小均為617 bp,G+C含量差別很小,分別為59.6%、59.5%和 59.5%。說明三者的親緣關(guān)系較近。

2.3 RPB2基因片段序列分析

通過BLAST將小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌所測序列分別與其對應(yīng)的GenBank中已經(jīng)公布的同源序列(EU257590、EU257596、EU257607)比 對,相 似 性 分 別 為97.96%、97.59%和97.27%,表明測序結(jié)果準(zhǔn)確。再通過DNAMAN軟件進行分析,3種小麥腥黑粉菌的RPB2基因片段相似性為99.08%,存在著17個堿基的差異(圖2)。其中,小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌親緣關(guān)系更近。

圖 2 TCK、TCT和TLK的RPB2基因序列測序結(jié)果

2.4 RPB2基因的通用引物作為內(nèi)置對照引物的擴增結(jié)果

引物 CQUTCK2/CQUTCK3、RPB2-740F/RPB2-1365R分別能擴增出747 bp和617 bp的條帶。將2對引物相結(jié)合進行PCR擴增,TCK可以擴增出747 bp和617 bp的2條帶,3種小麥腥黑粉菌均能擴增出617 bp的條帶,而其他6種真菌均不能擴增出任何條帶(圖3)。說明 RPB2基因的通用引物可以作為小麥腥黑粉菌的通用引物,與 TCK的特異性引物相結(jié)合可以避免PCR反應(yīng)的假陽性及假陰性,提高 TCK分子檢測的準(zhǔn)確性。

圖3 RPB2基因引物RPB2-740F/RPB2-1365R和TCK特異引物CQUTCK2/CQUTCK 3的PCR擴增

3 討論

RPB2作為編碼RNA聚合酶II的第2大亞基核的基因片段,主要負責(zé)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄[12]。到目前為止,通過對擬南芥、番茄和杜鵑的核酸雜交試驗已經(jīng)證實了 RPB2基因是單拷貝的[13]。研究發(fā)現(xiàn),RPB2編碼的氨基酸序列在人類、果蠅、真菌和植物間具有高度的保守性[14]。因此,RPB2基因在研究生物的系統(tǒng)發(fā)育方面具有很高的價值。目前,國外已 將 RPB2基因與 ITS[5]、RPB1[2,5]、EF[6]、β-tubulin[15]等基因片段結(jié)合對植物及真菌進行分類及系統(tǒng)發(fā)育研究,國內(nèi)目前尚沒有相關(guān)的研究報道。

根據(jù)1999年12月2日簽署的《中美農(nóng)業(yè)合作協(xié)議》,我國對等于或低于允許量(50 g小麥樣品中3萬個TCK孢子)的美國小麥應(yīng)不采取任何特殊措施直接進入中國國內(nèi)任何一個地區(qū),入世后美國及其他國家TCK疫區(qū)的小麥會繼續(xù)大量出口我國,隨著TCK疫區(qū)輸華小麥總量上升,隨疫麥進口帶入的TCK冬孢子必然呈總體上升趨勢,這將對我國的小麥生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅。小麥矮腥黑粉菌與其近緣種小麥光腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌在孢子形態(tài)上極為相似,僅僅依靠形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分,準(zhǔn)確性較差,而生化鑒定操作時間較長[11]。尋找小麥腥黑粉菌的特異性基因片段序列,并利用其進行系統(tǒng)分類是一種切實可行的方法。目前,一些學(xué)者對小麥矮腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌和小麥網(wǎng)腥黑粉菌的ITS[16]、IGS[17]基因片段進行了研究,并通過對IGS區(qū)的序列分析設(shè)計出小麥光腥黑粉菌的特異引物。陳萬權(quán)等[18]采用AFLP引物對小麥腥黑粉菌基因組DNA進行擴增,發(fā)現(xiàn)了小麥矮腥黑粉菌的特異性分子標(biāo)記。在其他基因片段的研究方面,目前尚沒有相關(guān)的報道。本試驗通過對3種小麥腥黑粉菌的RPB2基因片段的研究,分析了3種小麥腥黑粉菌在RPB2基因片段上的差異以及親緣關(guān)系,這為后續(xù)的特異性引物開發(fā)以及黑粉菌的系統(tǒng)發(fā)育研究奠定了基礎(chǔ)。利用RPB2基因片段引物結(jié)合小麥矮腥黑粉菌的特異引物做內(nèi)置對照進行PCR擴增,可作為小麥矮腥黑粉菌PCR檢測的輔助手段,以提高檢測的準(zhǔn)確性。

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