傅本重, 吳茂森, 陳華民, 何晨陽(yáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

生物膜是細(xì)菌通過(guò)胞外基質(zhì)(多糖、蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等)聚集附著于生物或非生物表面、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的群落[1]。無(wú)論是在自然環(huán)境還是在人工條件下,許多細(xì)菌主要以生物膜形式存活[2]。細(xì)菌生物膜不僅可引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和健康問(wèn)題(如對(duì)抗生素抗性和生物污染等)[3],而且它還是一個(gè)重要的致病因子,在人類致病菌以及植物-病原物互作中具有毒性作用的功能[4-5]。如植物病原細(xì)菌柑橘潰瘍病菌和苛養(yǎng)木桿菌生物膜形成在其定殖和病害循環(huán)中起重要的作用[6-7]。

水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是一種世界范圍內(nèi)引起水稻嚴(yán)重病害的病原細(xì)菌[8]。長(zhǎng)期以來(lái),人們一直致力于Xoo生物學(xué)性狀的研究,但有關(guān)其生物膜的研究鮮有報(bào)道。為了闡明Xoo在人工離體培養(yǎng)條件下生物膜形成及其影響因素,本研究分析了不同培養(yǎng)條件對(duì)Xoo生物膜形成的影響,利用結(jié)晶紫染色快速測(cè)試法,測(cè)定了Xoo不同菌株的生物膜形成能力。本研究結(jié)果不僅建立適合于Xoo生物膜形成能力的測(cè)定方法,而且也為研究Xoo生物膜產(chǎn)生機(jī)制及其在致病過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和材料

本試驗(yàn)所用菌株及其來(lái)源列于表1。Xoo菌株用M210培養(yǎng)基(酶水解干酪素8 g/L、蔗糖5 g/L、酵母提取物 4 g/L、K 2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H 2 O 0.3 g/L、pH 7.0)在28℃培養(yǎng);基因缺失突變體和互補(bǔ)菌株的培養(yǎng)加入相應(yīng)抗生素,使用濃度為慶大霉素(Gm)30μg/mL,壯觀霉素(Sp)40μg/mL。結(jié)晶紫購(gòu)自Amresco公司。96孔聚苯乙烯微量板為Axygen公司產(chǎn)品。

表1 本研究所用菌株來(lái)源

1.2 PXO99A在不同培養(yǎng)條件下生物膜形成的測(cè)定

挑取Xoo野生型菌株P(guān)XO99A的單菌落,接種于M 210,振蕩培養(yǎng)(120 r/min,28℃)至指數(shù)生長(zhǎng)期(A600=2.0)或平臺(tái)期(A600=3.5),進(jìn)行以下不同培養(yǎng)和測(cè)試條件的處理。參照文獻(xiàn)[9]描述的結(jié)晶紫染色法進(jìn)行生物膜測(cè)定。每個(gè)測(cè)試樣品設(shè)5個(gè)重復(fù),所有試驗(yàn)重復(fù) 3次。

測(cè)試材料:取1、2 mL和150μL指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,分別加入1.5 mL聚丙乙烯離心管、15 mm×150 mm玻璃試管和96孔聚苯乙烯微量板孔中,在28℃靜止24 h后,測(cè)試生物膜形成。

生長(zhǎng)期:取150μL指數(shù)生長(zhǎng)期或平臺(tái)期的菌液,加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在28℃靜止培養(yǎng)12、18 h和 24 h后,測(cè)試生物膜形成。

培養(yǎng)時(shí)間:取150μL指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在 28℃靜止6、8、10 h、12、18、24 h和48 h,測(cè)試生物膜形成。

培養(yǎng)溫度:取150μL指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在18、23、28℃和33℃靜止培養(yǎng)24 h后,測(cè)試生物膜形成。

培養(yǎng)基:取 10 mL指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,離心(5 000 r/min,10 min)收集菌體;加入10 mL新鮮M 210或 LB培養(yǎng)基,重新懸浮細(xì)菌;取150μL菌懸液加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在 28℃靜止24 h后,測(cè)試生物膜形成。

1.3 Xoo不同野生型、突變體及其互補(bǔ)菌株生物膜形成的測(cè)定

挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落,接種于M210中,振蕩培養(yǎng)(120 r/min,28℃)至指數(shù)生長(zhǎng)期(A600=2.0)。取150μL培養(yǎng)菌液加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在23℃靜止培養(yǎng)24 h后,用結(jié)晶紫染色法測(cè)試其生物膜的形成。每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)重復(fù),所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)和測(cè)試條件對(duì)PXO99A生物膜形成的影響

為了闡明不同材料表面對(duì)Xoo菌株P(guān)XO99A生物膜形成的影響,本研究首先檢測(cè)了病菌在塑料離心管、玻璃試管和96孔聚苯乙烯微量板3種不同材料表面生物膜的產(chǎn)生能力。PXO99A在3種材料表面都能產(chǎn)生生物膜,而在96孔聚苯乙烯板上形成的生物膜明顯而穩(wěn)定(圖1)。因此,本研究選用96孔聚苯乙烯板進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)分析。

圖1 PXO99A在不同材料表面生物膜的形成

有報(bào)道認(rèn)為細(xì)菌能在聚苯乙烯表面24 h內(nèi)形成生物膜[5],因此,本研究對(duì)PXO99A生物膜形成最佳時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了確定。PXO99A在6 h開始形成非常弱的生物膜,從18 h到48 h能形成較強(qiáng)的生物膜,其中24 h形成能力最強(qiáng)(圖2)。對(duì)不同生長(zhǎng)期細(xì)菌的生物膜測(cè)試表明,指數(shù)期和平臺(tái)生長(zhǎng)期細(xì)胞靜止培養(yǎng)24 h后都形成明顯的生物膜,指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的生物膜形成能力更強(qiáng)(圖3)。

由于Xoo最適生長(zhǎng)溫度為26～28℃,本研究檢測(cè)了該生長(zhǎng)溫度上下5℃溫度范圍內(nèi)生物膜的形成情況。結(jié)果表明,Xoo在18～33℃均能形成生物膜,其中在23℃時(shí)形成能力最強(qiáng)(圖4)。

圖4 不同溫度下的PXO99A生物膜形成

對(duì)在M210或LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Xoo生物膜測(cè)試表明,更換新鮮培養(yǎng)基均降低生物膜形成能力,其中更換M210后減弱十分明顯(圖5)。

圖5 不同培養(yǎng)基中PXO99A生物膜的形成

2.2 不同地區(qū)的Xoo野生型菌株生物膜形成能力

對(duì)前期收集或采集的、來(lái)源于南方地區(qū)(云南和福建)和北方地區(qū)(河北、遼寧和吉林)的 14個(gè)Xoo野生型菌株進(jìn)行了生物膜測(cè)定。發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試菌株都能產(chǎn)生生物膜,但各菌株之間的生物膜形成能力存在差異,然而這些差異與地區(qū)來(lái)源無(wú)關(guān)(圖6)。

圖6 不同來(lái)源的野生型Xoo菌株生物膜形成

2.3 Xoo不同基因缺失突變體及其互補(bǔ)菌株生物膜形成的能力

對(duì)前期構(gòu)建的Xoo基因缺失突變體及其互補(bǔ)菌株[10]的生物膜形成進(jìn)行了測(cè)定(圖7)。與野生型菌株P(guān)XO99A相比,鞭毛合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因突變體Δf leQxoo和基體蛋白基因突變體Δf liExoo、與H 2O2降解有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因突變體Δoxy Rxoo生物膜形成能力均顯著降低,而糖基轉(zhuǎn)移酶基因突變體Δrbf Cxoo生物膜形成能力明顯增強(qiáng)。所有相應(yīng)的互補(bǔ)菌株可以不同程度地恢復(fù)到與PXO99A相似的表型。

圖7 Xoo不同突變株生物膜形成

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期以來(lái),對(duì)包括Xoo在內(nèi)的病原黃單胞菌生物膜研究一直沒有一套標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范和準(zhǔn)確的快速測(cè)定方法,生物膜測(cè)試結(jié)果模糊,需要的菌液體積較大、試劑多,并且操作不便,容易產(chǎn)生誤差。因此,本研究首先重點(diǎn)分析了不同培養(yǎng)條件(塑料和玻璃表面、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基)對(duì)Xoo生物膜形成的影響,發(fā)現(xiàn)在聚苯乙烯界面、用M 210培養(yǎng)基、在23℃靜止培養(yǎng)24 h是檢測(cè)Xoo生物膜形成的適宜條件,從而為Xoo生物膜形成能力分析提供了一套快速可行的測(cè)定方法。有研究表明,適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度利于彎曲桿菌在不銹鋼材料表面的生物膜形成[11],其原因可能是由于生物膜依賴的基因表達(dá)增強(qiáng)引起的[12]。培養(yǎng)基對(duì)生物膜的影響可能主要是由于提供的營(yíng)養(yǎng)條件變化引起的。在生長(zhǎng)到指數(shù)期的細(xì)胞培養(yǎng)物中,營(yíng)養(yǎng)成分大部分已經(jīng)被消耗,營(yíng)養(yǎng)受到限制而促進(jìn)生物膜的形成。更換新鮮培養(yǎng)基后,生物膜形成能力下降。

本研究利用建立起的這一套相對(duì)規(guī)范的結(jié)晶紫染色法,測(cè)定了不同地區(qū)來(lái)源的Xoo野生型菌株、不同基因缺失突變體及其互補(bǔ)菌株的生物膜形成能力。發(fā)現(xiàn)所有野生型菌株都能產(chǎn)生生物膜(盡管生物膜形成能力存在一定的差異),這一結(jié)果表明生物膜產(chǎn)生在Xoo中是一個(gè)比較普遍的生物學(xué)性狀。此外,本研究發(fā)現(xiàn)Xoo鞭毛合成調(diào)控或組成基因f leQxoo、f liExoo和rbf Cxoo以及H 2O2降解調(diào)控基因oxy Rxoo的突變都影響生物膜形成。這些基因突變與生物膜形成之間的作用機(jī)理尚需深入研究。盡管有許多報(bào)道認(rèn)為生物膜形成是植物病原細(xì)菌一個(gè)新的致病機(jī)制,但是有關(guān) Xoo生物膜在Xoo-水稻互作中的功能尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

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