蔡小東，廖 偉

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

冰糖橙胚狀體、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生

蔡小東，廖 偉

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

以冰糖橙(Citrussinensis)成熟果實中未發(fā)育胚珠為外植體，以MT為基本培養(yǎng)基，通過添加不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑(ZT、GA3、BA、IAA以及2,4-D)、麥芽浸出物(ME)或AgNO3，誘導(dǎo)胚狀體、胚性愈傷組織，并進行了植株再生研究。結(jié)果表明：不同培養(yǎng)基不僅影響胚狀體的誘導(dǎo)率，而且影響誘導(dǎo)胚狀體的類型；MT培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)出球型胚狀體，MT+1.0 mg/L GA3+ 500 mg/L ME培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)子葉形胚狀體；不同類型的胚狀體在不同培養(yǎng)基中胚性愈傷組織發(fā)生的頻率不同，球形胚狀體和MT+0.5 mg/L IAA+0.1 mg/L ZT培養(yǎng)基最有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，球形胚狀體接種于此培養(yǎng)基上胚性愈傷組織的發(fā)生率高達40%。這些胚狀體經(jīng)過生芽和生根培養(yǎng)，再生了大量完整植株。

冰糖橙(Citrussinensis)；胚珠；胚狀體；胚性愈傷組織

柑橘胚性愈傷組織不僅可以作為種質(zhì)資源保存[1]、無病毒苗木培育[2,3]的原始材料,還廣泛應(yīng)用于原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合[4,5]以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究中。因此，建立冰糖橙胚性愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系，通過轉(zhuǎn)化或體細胞雜交等方法進行冰糖橙品種的遺傳改良,或通過胚性愈傷組織培育無病毒苗，在冰糖橙生物技術(shù)研究中具有重要的意義。雖然冰糖橙胚性愈傷組織的誘導(dǎo)已有報道[6]，但隨著繼代次數(shù)的增加和保存時間的延長，愈傷組織的胚胎發(fā)生能力會下降，并且存在變異[7,8]。因此，有必要誘導(dǎo)新鮮的冰糖橙胚性愈傷組織，用于柑橘生物技術(shù)育種。

目前，通常以幼嫩的珠心組織、實生苗的下胚軸或成熟果實中的未發(fā)育胚珠等為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的胚性愈傷組織[1,6,7,9,10]。本研究以冰糖橙成熟果實中未發(fā)育胚珠為外植體，進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生，通過探討不同培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件等對未發(fā)育胚珠胚性愈傷組織、胚狀體發(fā)生率的影響，以找到較適合冰糖橙成熟果實中未發(fā)育胚珠誘導(dǎo)胚性愈傷組織的適合方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為冰糖橙(Citrussinensis)成熟果實。在超凈工作臺上將果實浸泡在75%酒精中約8 min后，用鑷子取出并用酒精燈外焰灼燒30～60 s。接著將果實放入已滅菌的培養(yǎng)皿(內(nèi)放有多張濾紙)中剝開果皮，去掉果肉后可發(fā)現(xiàn)囊衣內(nèi)緊靠中柱處有許多長約1.5～2.5 mm未發(fā)育胚珠，用尖嘴鑷子將這些末發(fā)育胚珠輕輕挑下備用。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以MT為基本培養(yǎng)基，通過添加不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑(ZT、GA3、BA、IAA以及2,4-D)、麥芽浸出物 (ME) 或AgNO3，共設(shè)計4種用途共12種培養(yǎng)基 (表1)。其中培養(yǎng)基A～I用于胚性愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)基J為胚狀體增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基K為胚狀體生芽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基L為誘導(dǎo)芽生根培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖采用暗培養(yǎng)，其余均在光照周期14 h/8 h條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為24～26 ℃。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 The composition of induction media

1.3 胚性愈傷組織和體細胞胚胎的誘導(dǎo)

將冰糖橙未發(fā)育胚珠分別接種于上述培養(yǎng)基A、B、C、D、E中，每個處理培養(yǎng)10～11瓶，每瓶接種5個外植體，60 d后對胚性愈傷組織及胚狀體的誘導(dǎo)頻率進行統(tǒng)計。將獲得的胚狀體分別轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基A、B、F、G、H、I中以誘導(dǎo)胚性愈傷組織，每個處理接種5瓶，每瓶接種5個胚狀體，45 d后對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率進行統(tǒng)計。再生的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至未添加任何激素和附加物的培養(yǎng)基A進行增殖培養(yǎng)。

1.4 植株再生

將部分胚狀體轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基J進行增殖培養(yǎng)，使其體積進一步增大，發(fā)育到子葉期的胚狀體轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基K上誘導(dǎo)生芽，將芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基L上誘導(dǎo)生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚狀體的再生

表2 不同培養(yǎng)基上胚狀體的誘導(dǎo)率Table 2 The regeneration percentage of embryoids cultured on different media

將冰糖橙成熟果實中未發(fā)育胚珠接種于上述培養(yǎng)基A、B、C、D、E中，暗培養(yǎng)60 d后，結(jié)果如表2所示，5種供試培養(yǎng)基中除培養(yǎng)基B外其它4種都能誘導(dǎo)胚狀體的再生(表2)。培養(yǎng)基A和C既能誘導(dǎo)球形胚狀體的產(chǎn)生，也出現(xiàn)了子葉形胚狀體。在這5種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基A中球形胚狀體的誘導(dǎo)率為21.8%；培養(yǎng)基D中子葉形胚狀體誘導(dǎo)率高達28%；培養(yǎng)基E中只觀察到球形胚狀體。但是，在胚狀體的再生過程中，都未發(fā)現(xiàn)有胚性愈傷組織的出現(xiàn)。這些胚狀體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，有次生胚狀體發(fā)生，大部分表現(xiàn)畸形。圖1A所示為A培養(yǎng)基中再生的球形胚狀體，且再生了許多次生胚狀體，由于暗培養(yǎng)這些胚狀體呈淡黃色。圖1B所示為培養(yǎng)基中C中再生的子葉形胚狀體。培養(yǎng)基D中個別胚狀體甚至再生了根(圖1C)

A.球形胚狀體 B.子葉形胚狀體 C.生根胚狀體 圖1 胚狀體再生Figure 1 Embryoid regenration

2.2 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

圖2 從球形胚狀體誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織Figure 2 Embryogenic callus induced from globular embryoids

培養(yǎng)基胚狀體類型接種胚狀體數(shù)目胚性愈傷組織發(fā)生率/%ABFGHI球形2520子葉形250球形2516子葉形2516球形250子葉形254球形254子葉形250球形2540子葉形2520球形2512子葉形258

為獲得冰糖橙胚性愈傷組織，本研究將上述球形胚狀體和子葉形胚狀體分別轉(zhuǎn)移至新鮮胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基A、B、F、G、H、I中。暗培養(yǎng)45 d后，這些胚狀體形成了大量次生胚狀體，部分三角瓶出現(xiàn)乳白色、質(zhì)地疏松的胚性愈傷組織，且部分胚狀體出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象。圖2所示為培養(yǎng)基B中再生的胚性愈傷組織。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表3所示。從表3可以看出，培養(yǎng)基B、H、I既能誘導(dǎo)球形胚狀體產(chǎn)生胚性愈傷組織，也能誘導(dǎo)子葉形胚狀體產(chǎn)生胚性愈傷組織；培養(yǎng)基A、G只能誘導(dǎo)球形胚狀體產(chǎn)生胚性愈傷組織；培養(yǎng)基F只能誘導(dǎo)子葉形胚狀體產(chǎn)生胚性愈傷組織。球形胚狀體在培養(yǎng)基H上誘導(dǎo)率最高，高達40%；子葉形胚狀體在培養(yǎng)基H上的誘導(dǎo)率也高達20%。

2.3 胚狀體和胚性愈傷組織的增殖

將部分子葉形胚狀體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基J上進行增殖培養(yǎng)，在光照條件下培養(yǎng)15 d后，子葉形胚狀體逐漸變綠，有次生胚狀體的產(chǎn)生，30 d后胚狀體體積明顯增大。少數(shù)胚狀體萌發(fā)了小芽(圖3A)。球形胚狀體在黑暗中培養(yǎng)，30 d后體積明顯增大，也有次生胚狀體的產(chǎn)生(圖3B)。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到未添加激素的A培養(yǎng)基中增殖，黑暗中培養(yǎng)，25 d左右出現(xiàn)大量顆粒小、乳白、質(zhì)地疏松的胚性愈傷組織，少部分分化出胚狀體(圖3C)。

2.4 胚狀體生芽及生根

將增殖培養(yǎng)后的部分胚狀體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基K中誘導(dǎo)芽的再生，光照培養(yǎng)45 d后大部分都長出綠色芽，部分長出叢芽。切下分化出的1～2 cm長的芽，接種到培養(yǎng)基L中，光照培養(yǎng)1個月后所有芽均生根，葉色濃綠，根淡黃色。

A增殖的子葉形胚狀體 B增殖的球形胚狀 C. 增殖30 d后的胚性愈傷組織圖3 從球形胚狀體誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織Figure 3 Embryogenic callus induced from globular embryoids

3 討論

前人研究表明，培養(yǎng)基中既添加500 mg/L麥芽提取物和GA3有利于柑橘未發(fā)育胚珠胚性愈傷組織的誘導(dǎo)[6]。而本研究結(jié)果卻與之有差異：添加500 mg/L麥芽提取物和l mg/L GA3的培養(yǎng)基D并不能促進胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，只能促進胚狀體的發(fā)生，并且出現(xiàn)的都是子葉形胚狀體；培養(yǎng)基B不僅沒有誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，而且也沒出現(xiàn)胚狀體。生長素類物質(zhì)部分或完全抑制體細胞胚胎發(fā)生[11]，培養(yǎng)基E中胚狀體發(fā)生率低可能與BA和IAA濃度較高有關(guān)。在誘導(dǎo)胚性愈傷組織的過程中，添加AgNO3的培養(yǎng)基G并不能促進胚性愈傷組織的形成，這與范永梅等[12]的研究結(jié)果相一致。在愈傷組織的增殖過程中，會有小部分分化出胚狀體，并且時間的越長分化出的胚狀體就越多。呂柳新等[9]認為產(chǎn)生體細胞胚胎的多少與培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，胚狀體可直接由成熟果實的未發(fā)育胚珠產(chǎn)生，并能在以后的培養(yǎng)中不斷增殖，這說明未發(fā)育胚珠里的胚原基具有良好的胚胎發(fā)生潛力，并且可以由胚狀體誘導(dǎo)胚性愈傷組織。它是研究柑桔柑橘原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合中利用生物技術(shù)進行品種改良和種質(zhì)資源保存，以及無病毒苗木培育的良好試材。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基A中的胚狀體培養(yǎng)35 d后大部分都會變成水漬狀，這可能與胚狀體培養(yǎng)中的一些生理生化指標(biāo)相關(guān)，需要進一步的研究。

[1]霍合強，鄧秀新．寬皮柑橘品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)[J]．實驗生物學(xué)報，1999，32(3)：289～295.

[2]譚祖國，萬蜀淵．朋娜和紐賀爾臍橙胚珠離體培養(yǎng)獲得無病毒珠心苗方法研究[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，38(4)：43～45.

[3]董高峰，李耿光，張?zhí)m英，等．柑桔無病原體苗培育研究進展[J]．廣西植物，2001，21(1)：53～58.

[4]Grosser J W，Ollitrault P，Olivares-Fuster O. Somatic hybridization inCitrus：An effective tool to facilitate variety improvement[J]. In Vitro Cell Dev Biol- Plant，2000，36：434～449.

[5]Cai X D，F(xiàn)u J，Chen C L，etal. Cybrid/hybrid plants regenerated from somatic fusions between male sterileSatsumamandarinand seedy tangelos[J]. Sci Hortic，2009，122：323～327.

[6]范永梅，甘 霖，鄧秀新．冰糖橙胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生[J]．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2003，22(4)：399～402

[7]霍合強，鄧秀新．柑桔胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、保存和利用[J]．植物生理學(xué)通訊，2000，36(2):181～187.

[8]張俊娥，鄧秀新．柑橘愈傷組織植株再生及其倍性鑒定[J]．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，26(2)：237～238.

[9]呂柳新，林順權(quán)．3種柑橘亞科植物的珠心組織培養(yǎng)[J]．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，32(1)：193～195.

[10]張秀枝．紅江橙與檸檬愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，39(1)：6～11.

[11]Jimenez V M，Guevara E，Herrera J，etal. Endogenous hormone levels in habituated nucellarCitruscallus during the initial stages of regeneration [J]. Plant Cell Rep，2001，20：92～100.

[12]范永梅，李東棟，甘 霖，等．硝酸銀對冰糖橙胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，29(4)：338～340.

2010-01-12

國際科學(xué)基金(International Foundation for Science，IFS)項目(D/4756-1)

蔡小東(1978-)，男，湖北浠水人，農(nóng)學(xué)博士，講師，主要從事園藝植物生物技術(shù)育種研究

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.014

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S056-04