郭 艷 石 蓓 王正龍 王冬梅 許官學

(遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內科，遵義 563003)

引言

經皮冠狀動脈介入治療(percataneous coronary artery interventional therapy，PCI)是臨床上治療冠心病最有效的血運重建手段，但其術后再狹窄問題一直是影響其遠期療效的重要因素;目前認為PCI術后再狹窄的發(fā)生可能與內皮損傷、平滑肌細胞增殖和遷移致新近內膜增生等病理損傷修復反應有關。研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)除具有多向分化潛能外，還能分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多種細胞因子，在干細胞分化成心肌細胞及血管內皮中發(fā)揮積極作用，但其是否參與血管損傷修復及在其中扮演的角色目前尚不清楚。本研究擬通過觀察MSCs移植后的歸巢情況，以及模型兔血管內膜增生過程中平滑肌細胞凋亡率的變化，初步探討MSCs對模型兔球囊成形術后內膜增生的抑制作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型與分組

60只新西蘭雄性大白兔，體重(2.0±0.5)kg。隨機分為MSCs移植組(n=30);對照組(n=30)。其中兩組動物均構建動脈粥樣硬化狹窄模型并接受球囊成形術，移植組接受MSCs移植，對照組接受同等體積的無血清培養(yǎng)液注射。兩組均分別于術后7、14、28 d(n=10)分別采集外周血標本(用于另一部分實驗內容)，留取病變側及作為對照的對側血管段標本，分別截取每份標本前后兩端及中部約3～4 mm的血管組織進行石蠟包埋待用。

1.1.2 試劑與儀器

L－DMEM培養(yǎng)液(Sigma公司 貨號:D5523)。胎牛血清(FBS)(天津 灝洋生物制品科技責任有限公司)。胰蛋白酶、二甲基亞楓(北京拜爾迪生物公司)。淋巴細胞分離液(上海恒信化學試劑有限公司)。G－CSF(長春 金賽藥業(yè)批號:S10980099);鼠抗兔 CD34、CD45、CD44 抗體(USBiological公司，美國);Ad－GFP包裝病毒液為Dr.Tuet I(USA)惠贈;HEK293細胞為本院中心實驗室保存。GFP一抗(CHEMICON Inter－national公司，加拿大)、α－平滑肌肌動蛋白一抗(abcam公司美國)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(R＆D Systems，美國)、CD31一抗(武漢博士德公司)、通用型免疫組化二抗試劑盒(武漢博士德公司)，其它試劑為國產分析純，正壓不銹鋼過濾器為星光機械制造廠生產。CO2孵育箱(Thermo，美國)、光學倒置顯微鏡 (TMS－1015型)(OLYMPUS，日本)、倒置熒光顯微鏡(TE2000－S 型)(Nikon，日本)、流式細胞計數(shù)儀(FACS Calibur)(Becton－Dickinson，美國)，2.5 mm 直徑的球囊導管購自Cordis公司，微量注射泵購自 Terumo公司(日本)。病理圖像分析系統(tǒng)(Leica Qwin，德國)等。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的動員、分離及培養(yǎng)

以 G－CSF30 μg/kg·d連續(xù) 5 d于種兔腹壁皮下注射給藥，于第6 d在接受干細胞動員兔的耳中央動脈無菌采血20 mL，密度梯度離心法分離出其中的單個核細胞，新鮮無血清培養(yǎng)液洗滌兩次，然后接種于含15%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/mL的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2濃度、飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。原代培養(yǎng)4～5 d后初次換液，棄去非貼壁細胞，以后每3 d換液一次，大約10 d左右可傳代，此后每3～4 d傳一代，生長不良的細胞棄去，傳到第3代長至80% ～90%融合時用于移植。移植時用0.25%胰蛋白酶進行消化，無血清及抗生素的新鮮DMEM培養(yǎng)液重懸，調整密度為1×107/mL備用。

1.2.2 MSCs的鑒定

分別用第3代 MSCs先后與 CD34、CD44、CD45抗體及異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的二抗37℃孵育30 min，然后用1%的多聚甲醛固定后進行流式細胞儀檢測。

1.2.3 GFP載體腺病毒(Ad－GFP)的擴增及滴度測定

待HEK293細胞生長至70% ～80%融合時，棄培養(yǎng)液以Ad－GFP包裝病毒液進行感染，4 h后加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在293細胞出現(xiàn)明顯的致病變效應同時發(fā)出強烈熒光(約3～5 d)時收集細胞，通過反復凍融法得到高滴度的重組腺病毒，可反復擴增。用空斑形成實驗測定病毒滴度。

1.2.4 MSCs的標記

取第3代長至80% ～90%融合的 MSCs，在含2%血清培養(yǎng)液中加入感染復數(shù)為300(預實驗得出的最佳感染復數(shù))的Ad－GFP孵育細胞過夜，換新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天監(jiān)測熒光情況和生長情況。

1.2.5 動脈粥樣硬化模型的建立及細胞移植

按課題組已成功構建的方法和標準［1］建立兔動脈粥樣硬化模型，在嚴格無菌條件下行右頸總動脈球囊成形手術:動物經3%戊巴比妥1 mL/kg靜脈麻醉，頸部用5%硫化鈉脫毛后清潔消毒皮膚，作頸正中切口暴露氣管，分離右側頸內、外動脈和頸總動脈。肝素100 U/kg抗凝，在距離頸總動脈分叉處約0.5 cm處結扎頸外動脈，在結扎線近心側進行穿刺，送入直徑2.5 mm球囊至頸總動脈，600 kPa充盈球囊后緩慢拖動，持續(xù)1 min，間歇1 min后重復，總共3次，使頸總動脈損傷長度大約3 cm，撤出球囊，在穿刺點近心端處結扎頸外動脈，關閉術口。將事先準備好的MSCs按107個/kg的總量通過耳緣靜脈注入模型兔體內，對照組注入同等體積的無血清及抗生素培養(yǎng)液。青霉素80萬單位/只/d連用3 d預防感染。

1.2.6 免疫組化

MSCs移植后分別于 7、14、28 d取材的血管組織石蠟切片用SABC法進行GFP、CD31免疫組化染色;內皮化程度通過測定CD31染色陽性細胞吸光度及陽性率，并計算其吸光度值與陽性率的乘積，得出陽性指數(shù)。平滑肌細胞凋亡檢測:先以α－actin(α平滑肌肌動蛋白)染色標記血管平滑肌細胞，陽性指數(shù)=灰度×陽性面積/統(tǒng)計場總面積，以3個不同橫截斷面的平均數(shù)來表示該組織的免疫組化定量的最后數(shù)值;再用TUNEL法標記凋亡細胞，雙陽性細胞為凋亡的血管平滑肌細胞，計算陽性細胞核占同類總細胞核的百分比，以3個不同橫截斷面的平均值表示該組織的細胞凋亡率。通過光學顯微鏡和計算機圖像分析系統(tǒng)(leica Qwin，德國)，分析MSCs移植后的歸巢、平滑肌細胞凋亡率及損傷血管再內皮化情況。

1.2.7 形態(tài)學分析

MSCs移植后28 d時空氣栓塞法處死動物，留取病變血管標本(取未損傷側做正常對照)常規(guī)處理后制成4 μm厚的血管橫斷面切片。切片進行weigert彈力纖維染色及HE染色，通過光學顯微鏡、Leica Qwin病理圖像分析系統(tǒng)測算內膜面積、內膜中膜面積比、再狹窄率。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。定量資料實驗結果以表示，均數(shù)間差異采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 G－CSF動員骨髓 MSCs

在兔身上 G－CSF30 μg/kg·d連續(xù)應用 5 d后采集的外周血中，能夠分離出MSCs并進行體外擴增(見圖1)。

圖1 體外培養(yǎng)的外周血 MSCs(倒置相差顯微鏡，100×)(a)原代培養(yǎng)第7 d;(b)傳代培養(yǎng)(第3代)Fig.1 Peripheralblood mesenchyme stem cells cultured in vitro.(Inverted phase contrast microscope 100×).(a)primary cells cultured for 7days;(b)passaged cells.(passage 3)

2.2 MSCs的鑒定

形態(tài):生長較稀時胞體呈長梭形，兩端有長突起，胞質內顆粒較多，折光性差，核不清楚;長至融合時細胞變得扁平，胞體狹長，有長突起，核呈橢圓形，呈魚群樣、漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列。表面標志:流式細胞儀檢測結果:CD34陽性率是0.57%;CD45陽性率是0.47%;CD44陽性率是92.4%。

2.3 攜GFP腺病毒擴增、滴度測定及轉染MSCs

HEK293細胞感染Ad－GFP后48 h可觀察到微弱熒光表達，72 h可以觀察到明亮的熒光，平均96 h出現(xiàn)完全病變效應同時監(jiān)測到強烈的綠色熒光，此時收獲細胞用反復凍融法可以得到高滴度的腺病毒，測得病毒滴度為1.38×1011pfu/mL。用感染復數(shù)為300的Ad－GFP轉染 MSCs不影響細胞的生長和增殖，平均轉染率為75%(見圖2)。

圖2 標記上GFP基因的MSCs(倒置熒光顯微鏡，100×)Fig.2 Mesenchyme stem cells labeled with enhanced green fluorescent protein genes (Fluorescence m icroscope，100 × )

2.4 免疫組化

于各個時間段均可見MSCs移植組血管近內膜附近有GFP陽性細胞分布，大部分分布在血管內膜，也有少部分在外膜，中膜偶見;但未損傷血管及對照組血管則無(見圖3);各個時段的移植組平滑肌細胞凋亡率均顯著高于對照組(P＜0.01)(見圖4及表1);而再內皮化情況分析顯示移植組明顯優(yōu)于對照組(P＜0.01)(圖5及表2)。

表1 MSCs移植后不同時間點血管平滑肌細胞凋亡率 (ˉx± s，n=10)Tab.1 The apoptosis ratio of the vascular smooth muscle cell after MSCs transplantation(，n=10)

表1 MSCs移植后不同時間點血管平滑肌細胞凋亡率 (ˉx± s，n=10)Tab.1 The apoptosis ratio of the vascular smooth muscle cell after MSCs transplantation(，n=10)

注:*P＜0.01，移植組與同一時間點對照組比較;＆P＜0.01，7 d與同組14 d比較;s P＜0.01，#P＜0.05，14 d與同組28 d比較

移植后時間/d 移植組/% 對照組/%71.62±1.25*＆ 0.41±0.20＆0.33±0.1814 3.66±1.52*# 0.98±0.3028 2.03±1.05*

2.5 血栓情況

MSCs移植組無血栓形成，對照組有 2例(6.67%)先后在7 d及14 d內發(fā)生頸動脈內血栓形成 (見圖6)。

2.6 形態(tài)學分析

術后28 d血管形態(tài)學分析顯示移植組彈力纖維基本完好，中膜厚度變化不大，有少量新生內膜形成;而對照組彈力纖維多數(shù)斷裂，中膜變薄，有明顯的內膜增殖。定量測量內膜面積及再狹窄率顯著低于對照組(P＜0.01)(見表2及圖7)。

表2 兔血管成形術后28 d各組血管形態(tài)學分析結果(，n=10)Tab.2 The morphology analysis of blood vessels 28 days in rabbits postangioplasty(，n=10)

表2 兔血管成形術后28 d各組血管形態(tài)學分析結果(，n=10)Tab.2 The morphology analysis of blood vessels 28 days in rabbits postangioplasty(，n=10)

注:與對照組比較*P＜0.01#P＜0.05

陽性指數(shù)移植組 0.037±0.006* 0.223±0.037# 16.85±3.79* 22.54±2.80* 0.037±0.006內膜面積/mm2 中膜面積/mm2 (內膜/中膜)/% 再狹窄率/% CD31*.73 0.021±0.006對照組 0.086±0.009 0.183±0.041 48.94±8.98 44.02±3

2.7 實驗動物情況

在實驗期間兩組均無一例死亡;無手術切口感染或不愈合等情況;所有動物實驗期間飲食及排便情況均正常。

3 討論

PCI是目前冠狀動脈疾病最普及的血運重建方法。再狹窄問題則是影響其遠期療效的關鍵。其機制包括早期血管彈性回縮、內皮細胞損傷和平滑肌細胞的遷移與增殖、新生內膜增生及晚期血管重塑。藥物洗脫支架(drug－eluting stents，DES)的應用直接針對平滑肌細胞增殖和新內膜增生，大大減少了臨床再狹窄率。然而，當前應用的DES不針對炎癥和血栓而且可能抑制再內皮化，暗藏增加血管支架內晚期血栓形成的風險［2－4］。因此，針對血管成形術和支架術損傷血管的應答反應，仍然迫切需要尋找合理有效具有特異性的治療手段。

圖3 血管成形術后GFP的表達(免疫組化染色，100×).(a)術后7 d;(b)術后14 d;(c)術后28 dFig.3 The expression ofGFP in artery after angioplasty.(Immunohistochemisty staining 100×).(a)7daysafterangioplasty.;(b)14daysafter angioplasty.(c)28 days after angioplasty

研究發(fā)現(xiàn)，PCI導致的血管損傷誘導血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells VSMCs)的大量增殖，其發(fā)生與腫瘤發(fā)生有相似的分子生物學機制。因此，抑制平滑肌細胞增殖誘導平滑肌細胞凋亡成為治療再狹窄的重要途徑。有人曾測定正常人和動脈粥樣硬化行腔內旋磨術病人的頸動脈組織中促凋亡基因BAX的表達，結果發(fā)現(xiàn)正常動脈中無BAX表達，但在病變組織中有30%表達BAX，這提示血管組織中的凋亡可能是對抗各種損害因素誘導的細胞過度增殖的一種代償方式［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性動脈粥樣硬化組織中凋亡程度是低于再狹窄組織的［6］，而大量體內外實驗研究都提示，血管再狹窄組織中細胞增殖活性明顯高于原發(fā)性動脈粥樣硬化?？梢娫谠鲋郴钚詮姷慕M織中凋亡相應上調亦是其代償?shù)囊环N表現(xiàn)。但是，相對于血管成形術后損傷血管的細胞增殖活性，凋亡的代償顯然是不足的:Kamenz等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，在血管損傷后28 d內，尤其是1周內，平滑肌細胞增殖和內膜面積的增長最明顯，而細胞凋亡率持續(xù)于低水平，均低于1%，提示在血管損傷后細胞增殖能力增加的同時并無相應的凋亡上調，這為新內膜中的細胞數(shù)量和后繼的內膜面積的持續(xù)增長提供了可能?？梢姡交〖毎蛲鲈趦饶ぴ龊裰衅鹆酥匾饔?，而其凋亡不足是內膜損傷后動粥樣硬化進展及導致管腔狹窄的重要因素。

圖4 平滑肌細胞凋亡的標記(免疫組化雙染色，200×).(a)移植組;(b)對照組Fig.4 Smooth muscle cell labeledapoptosis(immuneohistochemisty double dyeing，200 ×)(a)transplantation groups;(b)control groups

上述研究表明，促使血管成形術后早期損傷血管平滑肌細胞凋亡可能是阻止再狹窄的一個重要靶點。而新近利用干細胞改善心肌梗死后心功能和左心室重塑已經被眾多研究者所認同，但是，其對血管成形術后血管損傷的修復作用如何尚無定論;其是否對上述靶點起作用尚未見報道。本研究前期的實驗利用MSCs干預頸動脈粥樣硬化球囊成形術模型兔，發(fā)現(xiàn)其能夠促進再內皮化，減少內膜面積，其中也發(fā)現(xiàn)歸巢到損傷部位的MSCs部分分化為內皮細胞，但是在術后28 d內測得最高分化效率為29.63%，推測血管獲益此并非全部因素。因此，我們又平行觀察了外周血MSCs移植在干預模型兔頸動脈粥樣硬化球囊成形術過程中，對術后血管平滑肌細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)外周血MSCs在體外可以大量擴增，以病毒介導增強型綠色熒光蛋白基因的轉染有較高的效率。MSCs移植后7，14、28 d的平滑肌細胞凋亡率均顯著高于對照組，其中移植后14 d達峰，到28 d有所下降但是仍然高于移植后7 d水平。對照組各時期凋亡率均較低，但是消長規(guī)律與移植組類似。此外，移植MSCs后28 d測定的內膜面積，再狹窄率同樣顯著低于對照組，內皮化程度高于對照組。本研究結果表明，經過G－CSF動員的外周血MSCs經過耳緣靜脈注入后可以歸巢到血管損傷部位，并可能通過促進平滑細胞凋亡以調節(jié)其過度增殖，從而顯著抑制術后新內膜形成、減少再狹窄率。

圖5 球囊成形術后28天CD31表達(免疫組化染色，100×)(a)移植組;(b)對照組Fig.5 Theexpressionof CD31 in artery 28 days afterangioplasty.(Immunohistochemisty staining，200×).(a)transplantation groups (b)control groups

圖6 頸動脈內血栓形成(HE染色，×100)Fig.6 Thrombopoiesis in carotid arteries(HE dyeing，×100)

圖7 正常及損傷血管術后28 d的內膜增殖情況(weigert染色，200×)(a)正常血管;(b)移植組;(c)對照組Fig.7 Intimal thickness of the injuried blood vessel 28 days after angioplasty.(weigert elastic fibers staining，200×)(a)normal blood vessel;(b)transplantation groups;(c)control groups.

新近對于MSCs通過旁分泌效應［8］以及對體內局部微環(huán)境的影響［9－10］發(fā)揮有益效應的研究正在受到越來越多的關注。動脈損傷后VSMCs的遷移、增殖和凋亡受到多種復雜因素的調節(jié)和影響。在血管損傷后炎癥細胞與內皮、平滑肌細胞和細胞外基質之間發(fā)生復雜的應答反應，伴隨著粘附分子，生長因子和細胞因子的表達增加，這些細胞因子的持續(xù)增加又反過來和血管功能障礙與疾病有關。Orlandi等發(fā)現(xiàn)［11］，動脈損傷后早期，VSMCs表達flt－1、c－kit等表面標志的比率明顯暫時性增加，而表達α－actin的比率急劇減少，但在損傷后期，VSMCs又恢復表達 α－actin，其間使用 flt－1封閉抗體可以部分減少VSMCs的增殖和遷移。這種VSMCs表型改變即是其對局部微環(huán)境改變做出的應答。另外，Maciel等也發(fā)現(xiàn)［12］在血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子β1、血小板衍生的生長因子協(xié)同調節(jié)下，骨形態(tài)生成蛋白拮抗物Guemlin在血管損傷早期可發(fā)揮促VSMCs凋亡作用，減少VSMCs的遷移和增殖?？梢姡淖儞p傷血管局部的微環(huán)境或物質成分可能對調節(jié)VSMCs增殖與凋亡之間的平衡發(fā)揮重要作用。而且，已有體外實驗證實完整的內皮細胞抑制VSMCs的遷移和增生，而內皮細胞缺損結果則反之，但是當加入MSCs共培養(yǎng)可一定程度上抑制這種反應［13］。結合本研究結果，推測 MSCs促進兔頸動脈血管成形術后VSMCs凋亡可能與其旁分泌效應改變損傷局部微環(huán)境有關，但詳細機制有待進一步研究。

綜上，本研究利用動脈粥樣硬化兔模型進行研究，這比較相似于臨床上從動脈粥樣硬化到血管成形術后再狹窄的過程，在本模型上發(fā)現(xiàn)外周血MSCs移植到體內后促進損傷血管平滑肌細胞的凋亡率增加，這可能是其降低血管成形術后再狹窄的因素之一;曾有研究者擔心誘導平滑肌細胞凋亡的措施會破壞粥樣斑塊纖維帽的結構，導致斑塊破裂和血栓形成，本實驗中移植組無一例發(fā)生血栓形成和斑塊內出血，而對照組均有發(fā)生，這提示本動物模型中MSCs移植不會惡化血管病變。至于MSCs具體通過何種確切機制去調控平滑肌細胞增殖與凋亡之間的平衡，以及在人體內其是否能重復上述效應有待進一步深入研究。

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