陳培華 張 威 陳 鵬 周子予 劉清君 王 平

(浙江大學(xué) 生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院 杭州 310027)

引言

迄今為止，人們知道有五種基本的味覺感受:酸、甜、苦、咸和鮮味，以為了動(dòng)物能夠避免食物腐敗，獲取能量，避免有毒物質(zhì)，維持體內(nèi)離子動(dòng)態(tài)平衡以及品嘗到美味。初級(jí)的味覺感受器為舌上皮中的味覺感受細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，哺乳動(dòng)物的味覺細(xì)胞可以分為四類:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和IV型。由于Ⅰ型味覺細(xì)胞為支持細(xì)胞，而Ⅳ型細(xì)胞為前體細(xì)胞，在味覺細(xì)胞的生命過程中不斷分化為其他類型的味覺細(xì)胞，這兩類細(xì)胞不能產(chǎn)生動(dòng)作電位，且在味覺感受中的作用目前還不清楚，因此Ⅰ型和Ⅳ型細(xì)胞不是本工作的研究重點(diǎn)。甜味受體 (T1R2/T1R3)［1］、苦味受體 (T2Rs)［2］和 鮮味受體 (T1R1/T1R3，mGluR4)［3－4］分別表達(dá)于不同群的Ⅱ型細(xì)胞中。而Ⅲ型細(xì)胞中表達(dá)了酸味受體，如ASIC 通道［5］和 /或 PKDL［6］通道。它們分別在相應(yīng)的味質(zhì)刺激下，Ⅱ型和ⅢI味覺細(xì)胞都能發(fā)放動(dòng)作電位?？墒茄芯孔C明Ⅱ型細(xì)胞與輸入神經(jīng)沒有經(jīng)典的突觸連接，Ⅲ型細(xì)胞是唯一一種與輸入神經(jīng)纖維有突觸連接的味覺細(xì)胞。于是，綜合最新的生物分子學(xué)、免疫組化、膜片鉗電生理、在體神經(jīng)記錄和動(dòng)物行為學(xué)等研究進(jìn)展，得到假設(shè)的味覺敏感傳導(dǎo)模型:IⅠ型細(xì)胞在苦甜鮮味味質(zhì)的刺激下，產(chǎn)生動(dòng)作電位，并釋放ATP到Ⅲ型細(xì)胞;Ⅲ型細(xì)胞在酸味味質(zhì)的刺激下，或是接受Ⅱ型細(xì)胞釋放的ATP的刺激下，產(chǎn)生動(dòng)作電位，并釋放5-HT到輸入神經(jīng)纖維，然后將味覺信息傳遞到大腦［7］，如圖1(a)所示。

對(duì)味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下的電生理記錄有膜片鉗全細(xì)胞記錄 (whole-cell)、細(xì)胞貼附式記錄(cell-attached)以及非緊密封接的細(xì)胞貼附式膜片鉗記錄 (loose-patch)［8］。由于傳統(tǒng)的膜片鉗記錄操作復(fù)雜且對(duì)細(xì)胞有損傷，不利于對(duì)細(xì)胞放電模式的長(zhǎng)時(shí)間記錄，于是衍生出非緊密封接的膜片鉗記錄方式。同時(shí)，由于胞內(nèi)電位以及跨膜電流也能通過胞外電位反映。于是采用 LAPS芯片，對(duì)味覺細(xì)胞的胞外電位進(jìn)行記錄。這是一種無損的、長(zhǎng)期的記錄方式，能對(duì)味覺細(xì)胞在味覺刺激下的時(shí)域放電模式做較長(zhǎng)時(shí)間記錄。本研究加工制作的LAP芯片以及LAPS測(cè)試系統(tǒng)如圖1(b，c)所示。

目前對(duì)味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下釋放的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的記錄是采用生物傳感細(xì)胞 (biosensor cell)［9］。即是采用細(xì)胞系HEK293或CHO細(xì)胞，將5-HT受體以及下游分子轉(zhuǎn)入該細(xì)胞中，并載入Ca2+敏感染料。在味質(zhì)刺激下，胞內(nèi) Ca2+濃度升高，采用熒光顯微鏡，記錄響應(yīng)的 Ca2+信號(hào)變化，從而反映有5-HT的釋放?？墒窃摲椒ǖ娜秉c(diǎn)是需要將生物傳感細(xì)胞培養(yǎng)在離味覺細(xì)胞很近的位置，才能使得釋放的5-HT被傳感細(xì)胞捕捉到。利用LAPS芯片可尋址的優(yōu)點(diǎn)，可將激光光點(diǎn)照射到芯片上任意一點(diǎn)做記錄。在LAPS芯片上附著一層約200 μm厚的對(duì)5-HT敏感的PVC膜，從而對(duì)味覺細(xì)胞組織釋放的5-HT進(jìn)行檢測(cè)。

本研究中，用LAPS對(duì)單個(gè)味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下的胞外電位做記錄，并利用主成分分析法分析不同類型的味覺細(xì)胞的時(shí)域響應(yīng);并在LAPS芯片上沉積5-HT敏感的PVC膜，對(duì)味質(zhì)刺激下，味覺細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)5-HT進(jìn)行記錄，測(cè)試在酸味或是苦甜鮮味味質(zhì)刺激下是否有5-HT釋放。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LAPS芯片為味覺細(xì)胞味覺敏感和傳導(dǎo)的研究提供了一種潛在的新方法。

圖1 味覺傳導(dǎo)模型，LAPS芯片及其測(cè)試系統(tǒng)。(a)味覺細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)模式;(b)加工的 LAPS芯片;(c)LAPS測(cè)試系統(tǒng)Fig.1 The transduction model of taste sensation，LAPS chip and its measurement system.(a)taste signal transduction model;(b)the fabricated LAPS chip;(c)LAPS measurement system

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 LAPS芯片及其檢測(cè)系統(tǒng)

采用電解液-絕緣層-半導(dǎo)體(EIS)結(jié)構(gòu)的LAPS芯片。選擇電阻率為10～15 Ω·cm的N型硅片。在1000℃ 熱生長(zhǎng)一層30 nm的SiO2，然后利用等離子增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積(PECVD)一層厚為60 nm的Si3O4。在基底背面再濺射一層1 μm的鋁作為歐姆接觸。鉑絲作為參考電極。LAPS檢測(cè)系統(tǒng)如圖1(c)所示，利用波長(zhǎng)為543.5 nm，調(diào)制頻率為4 kHz(由鎖相放大器控制)的激光照射在 LAPS表面，其光點(diǎn)直徑約為10 μm。掃描I-V曲線，取斜率最大的點(diǎn)作為記錄胞外電位時(shí)的工作電壓。味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下的胞外信號(hào)耦合在工作電壓上，并最終被LAPS記錄到，產(chǎn)生與胞外電位成比例的光生電流。通過恒電位/電流儀(EG＆G Princeton Applied Research，Model 273A)自帶的電極電路檢測(cè)出LAPS光生電流并轉(zhuǎn)換成電壓，經(jīng)過前置放大器及模擬濾波器進(jìn)行信號(hào)的放大和預(yù)處理，由16位PCI6035數(shù)據(jù)采集卡和LabVIEW軟件控制數(shù)據(jù)的采集、分析和存儲(chǔ)。

1.2 味覺細(xì)胞培養(yǎng)和舌上皮制備

選擇SD大鼠舌上皮的輪廓狀乳頭部分，取輪廓狀乳頭并置于半胱氨酸 (1 mg/mL)激活的木瓜蛋白酶緩沖液中(14 U/mL，無二價(jià)離子)，浸泡約為3 h(環(huán)境37℃，5%CO2，95% 空氣)。取舌上皮，這樣得到結(jié)構(gòu)松散的舌上皮，如果細(xì)胞有神經(jīng)遞質(zhì)釋放，便容易流出且被LAPS芯片檢測(cè)到。

在對(duì)單個(gè)味覺細(xì)胞的胞外電位檢測(cè)時(shí)，我們將上面步驟得到的味覺組織置于胞外液中，抖動(dòng)味覺組織，味覺細(xì)胞便從舌上皮中脫離，并培養(yǎng)在用Cell-TAK處理過的LAPS芯片上。在測(cè)試前，味覺細(xì)胞培養(yǎng)在 DMEM中 2 h(環(huán)境37℃，5%CO2，95%空氣)。

1.3 5-HT敏感膜制備

筆者在LAPS表面沉積一層對(duì)5-HT敏感的PVC膜，其成分包括離子交換劑 KTPClPB(0.5 mg)、溶劑調(diào)節(jié)劑 Tris(2-ehylhexyl)phosphate(60 mg)、PVC(30 mg)，溶于 1 mL 四氫呋喃中［10］。取該混合溶劑約7～8 μL滴在 LAPS芯片上，等溶劑在室溫下蒸發(fā)后，在LAPS芯片上留下一層對(duì)5-HT敏感的PVC膜，約為200 μm厚。之后，用1 mM的5－HT溶液對(duì)此膜進(jìn)行過夜活化。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 胞外電位檢測(cè)

利用可尋址電位傳感器(LAPS)對(duì)味覺感受細(xì)胞在味質(zhì)刺激下的電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)進(jìn)行記錄。在測(cè)量前將味覺細(xì)胞先培養(yǎng)2 h，在臺(tái)式液中，掃描I-V曲線，并將工作點(diǎn)電位設(shè)在I-V曲線上斜率最大的點(diǎn)并保持不變。如圖2(a)所示為Ⅱ型細(xì)胞在苦甜鮮混合刺激下 (MgSO4，蔗糖，谷氨酸)，Ⅲ型細(xì)胞在酸味刺激下(HCl)產(chǎn)生的時(shí)域放電。在酸味(pH=4)刺激下，味覺細(xì)胞的放電頻率為(2.9±0.3)Hz(n=14);在混合刺激下，味覺細(xì)胞的放電頻率為(2.54±0.32)Hz(n=10)(圖2(b))。當(dāng)使用相同的味質(zhì)(選取酸)，不同濃度刺激下，放電頻率則隨著濃度的改變?nèi)鐖D2(c)所示。在臺(tái)式液環(huán)境中時(shí) (pH=7.5)，味覺細(xì)胞有少許自發(fā)放電，放電頻率為(1.35±0.14)Hz(n=14);pH=4時(shí)，放電頻率為(2.9±0.3)Hz(n=14);當(dāng) pH=2時(shí)，放電頻率為(3.8±0.65)Hz(n=12)。采用主成份分析法 (PCA)對(duì)不同味質(zhì)刺激下的時(shí)域放電響應(yīng)分析表明來自于不同種類細(xì)胞的響應(yīng)形成了不同的簇，如圖2(c)所示。正方形為酸響應(yīng)，三角形為苦甜鮮響應(yīng)。

2.2 5-HT檢測(cè)

用不同濃度的5-HT溶液對(duì)該膜的特性進(jìn)行測(cè)試。在不同濃度5-HT的情況下，記錄IV曲線，它們會(huì)有一定程度的平移，如圖3(a)所示。線性擬合得到靈敏度為19.1 mVp5-HT(r=0.997)。LASP芯片上的舌上皮如圖3(b)所示。之后，對(duì)舌上皮分別施加酸味刺激 (圖3(c))和苦甜鮮混合刺激 (圖3(d))，發(fā)現(xiàn)Ⅳ曲線有不同程度的平移，其平移約為30～100 mV。

3 討論和結(jié)論

LAPS芯片對(duì)味覺細(xì)胞在不同味質(zhì)刺激下的電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)味覺細(xì)胞在不同味質(zhì)刺激下得到的放電頻率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果得到放電頻率相差不大，表明不同味質(zhì)不能簡(jiǎn)單的由味覺細(xì)胞的放電頻率表示和編碼。但是，在相同味質(zhì)不同濃度刺激下，放電頻率隨著濃度的增大而增大，揭示對(duì)味質(zhì)濃度的編碼可能依賴于參數(shù)放電頻率。對(duì)味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下的時(shí)域放電模式進(jìn)行PCA分析，結(jié)果表明:由Ⅱ型和Ⅲ型細(xì)胞的時(shí)域放電響應(yīng)能夠?qū)⒉煌愋臀队X細(xì)胞所攜帶的味覺信息分別出來。

LAPS芯片對(duì)味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下釋放的5-HT進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在味質(zhì)刺激前后，I-V曲線有不同程度的右移，大約在30～100 mV。通過 LAPS芯片對(duì)5-HT響應(yīng)特性分析，得到味覺細(xì)胞釋放的5-HT局部濃度大約為10－10－10－7M量級(jí)，與 Huang等人利用Ca2+熒光檢測(cè)方法得到的結(jié)果一致［9］。

圖2 味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下的時(shí)域放電。(a)味覺細(xì)胞在臺(tái)式液時(shí)、酸刺激下和混合刺激 (苦甜鮮)下的時(shí)域放電模式;(b)在酸刺激和混合刺激下的放電頻率;(c)隨pH降低，放電頻率增加;(d)對(duì)酸和混合刺激下的時(shí)域放電的主元分析PCA，酸和混合刺激分別聚集為兩簇，正方形:酸刺激;三角形:混合刺激Fig.2 Firing patterns of taste cells upon taste stimuli in time-domain.(a)Thefiringpatternsundertyrode solution，sour stimuli and mix stimuli(bitter，sweet and umami);(b)The firing rate with sour stimuli and mix stimuli;(c)The firing rate increases with pH decreasing;(d)PCA analysis of firing patterns upon sour and mix stimuli from time-domain.It forms two distinct cluster with sour and mix stimuli.Square:sour stimuli;Triangle:mix stimuli

通過LAPS芯片對(duì)味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)的胞外記錄，得到味覺細(xì)胞在味質(zhì)刺激下會(huì)產(chǎn)生動(dòng)作電位，味覺細(xì)胞在不同味質(zhì)刺激下的放電頻率難以用來分辨味質(zhì)，但味覺細(xì)胞在同種味質(zhì)刺激下放電頻率與味質(zhì)濃度成正比，不同類型的味覺細(xì)胞的響應(yīng)通過時(shí)域放電模式是能分辨的;另一方面在味質(zhì)刺激下，味覺細(xì)胞會(huì)釋放5-HT，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的釋放與味覺信息的傳遞可能相關(guān)。另外，LAPS胞外記錄方法為味覺細(xì)胞的味覺感受等提供了一種無損的新穎記錄方式。

圖3 在味質(zhì)刺激下舌上皮中味覺細(xì)胞釋放的5-HT記錄。(a)在各個(gè)5-HT濃度下LAPS芯片的響應(yīng);(b)鏡下LAPS芯片上的舌上皮;(c)在酸味刺激前后記錄的I-V曲線;(d)在苦甜鮮混合刺激前后記錄的I-V曲線Fig.3 The detection of released 5-HT from taste epithelium upon taste stimuli.(a)The response of LAPS chip to 5-HT with different concentrations;(b)The taste epithelium under microscope;(c)I-V curves before and after sour stimuli;(d)I-V curves before and after mix stimuli

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