武繼民,汪鵬飛,李志宏,袁曉燕

(1.天津大學 材料科學與工程學院,天津 300072;2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生裝備研究所,天津 300161)

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factors,bFGF)是一種具有廣譜作用的促進組織或血管形成生長因子[1-2]。bFGF在細胞外基質(zhì)(ECM)中是聯(lián)結細胞行為的專一信號因子,在創(chuàng)傷愈合中起到促血管化的主要作用[3-4],因此bFGF及其制劑的相關應用研究一直是組織工程支架材料、再生醫(yī)學、創(chuàng)傷治療領域最活躍的課題之一。但是,bFGF作為一種堿性多肽[5],在體內(nèi)擴散快、對熱和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短(3～5 min),因此其生物學效應不能得到充分發(fā)揮。如何有效地發(fā)揮bFGF的生物學效應制約著bFGF的進一步體內(nèi)應用研究,藥劑學的緩釋技術較好的解決了這個問題。通過微球包埋,使bFGF與外界的酶解環(huán)境相對隔離,能夠在相當長的時間內(nèi)緩釋藥物并使局部藥物濃度維持在一個相當?shù)乃健?/p>

本文研究篩選出較理想的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為緩釋載體,通過W1/O/W2溶劑揮發(fā)法(復乳法),對bFGF進行微納米包埋,制成bFGF-PLGA緩釋微球。并研究了其釋藥行為。

1 材 料

bFGF凍干粉劑(北京雙鷺生物制藥有限公司);PLGA(75/25,相對分子質(zhì)量5.0萬,山東醫(yī)療器械研究所);聚乙烯醇(PVA,純度:96%～98%,水解度:98%,聚合度:1 750±50,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司);bFGF ELISA試劑盒(雙抗夾心96孔,ADL進口分裝);二氯甲烷等試劑均為分析純。

JSM-6700F型場發(fā)射掃描電鏡(日本);X-520型高速勻漿機(美國);78-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇市富華電器廠);CR22G型超速冷凍離心機(日本);Freezone 6型真空冷凍干燥機(美國);DH4000A型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特醫(yī)療器械廠);SHA-CA型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀(美國)。

2 方 法

2.1 bFGF-PLGA微球的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備包埋bFGF的PLGA微球。將水溶性的bFGF溶于生理鹽水中作為內(nèi)水相(W1),PLGA溶于二氯甲烷中作為油相(O),不同濃度、體積的PVA水溶液作為外水相(W2)。將內(nèi)水相逐滴滴入油相中,以高速勻漿機在30 000 r/min下乳化1 min形成初乳(W1/O),待初乳穩(wěn)定后,將初乳液滴入一定體積不同濃度的PVA水溶液中(W2),15 000 r/min下攪拌3min形成復乳(W1/O/W2)。然后將復乳液倒入燒杯中,磁力攪拌揮發(fā)3～5 h,過濾,3 500～5 000 r/min離心15～20 min,去離子水洗滌、過濾后再離心,如此反復操作3～5遍,直至將多余的PVA清除。將樣品-20℃冷凍保存至少48 h;冷凍干燥24 h,收集微球粉末待用。

2.2 bFGF-PLGA微球表面形貌觀察

將少量的微球粉末放在貼有雙面膠的載玻片上,制成相應的掃描電鏡樣品,噴金后利用SEM觀察微球表面形貌。

2.3 ELISA檢測法及標準曲線的繪制

采用雙抗體夾心ELISA法測試,利用抗人bFGF單抗包被于酶標板上,標準品和樣品中的bFGF與單抗結合,加入生物素化的抗人bFGF抗體(二抗),它將與結合在單抗上的人bFGF結合而形成免疫復合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與二抗的生物素結合,加入TMB顯色。在450 nm波長處測定吸光度(A)值,bFGF濃度與A值成正比,可通過標準曲線求出樣品中bFGF濃度。

作標準曲線時,要扣除標準品稀釋液造成的本底;如果標本用標準品稀釋液稀釋,也要扣除標準品稀釋液造成的本底,如果樣品未用標準品稀釋液稀釋,不需扣除標準品稀釋液造成的本底。以濃度分別為600,300,150,75,37.5,18.75,9.38,0 pg/mL標準品濃度為橫坐標,以與之對應的A值為縱坐標,作圖建立bFGF的標準曲線并得出標準方程。然后根據(jù)樣品A值在該曲線圖上查出bFGF濃度。

2.4 微球中bFGF的載藥量和包封率測定

稱取微球20mg,加入二氯甲烷2mL中,使其完全溶解,再加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)1mL,充分攪拌、靜置、分液,收集水相凍存,ELISA法測定樣品A值。根據(jù)樣品A值及標準曲線計算待測液中bFGF的濃度,從而計算出測試微球中的bFGF含量。載藥量=(微球中bFGF質(zhì)量/微球總質(zhì)量)×100%;包封率=(微球中 bFGF質(zhì)量/投入bFGF總質(zhì)量)×100%。

2.5 微球中bFGF的體外釋放行為研究

稱取微球50mg裝入釋放管中,以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)10mL為釋放介質(zhì),于37℃振蕩速度為100 r/min的水浴恒溫振蕩器中,分別在0.5,1,2,3,5,8,12,17,23,30,45 d取出釋放介質(zhì)2mL于離心管中標號凍存待測并及時加入同樣體積的釋放介質(zhì)。

由標準曲線計算出微球中bFGF的釋放量,并計算累積釋放率,得到微球中bFGF的體外釋放曲線。突釋率為微球中藥物在第1天的累積釋放率。

3 結 果

3.1 微球的形態(tài)與粒徑

經(jīng)SEM觀察,bFGF-PLGA微球表面光滑無孔隙,球形好;形態(tài)及粒徑大小較均勻。如圖1所示。微球粒徑為(0.75±0.08)μm。

圖1 bFGF-PLGA微球表觀形貌SEM圖Fig.1 SEM image of bFGF-PLGA microspheres

3.2 標準曲線的建立

進行線性回歸得標準曲線方程:C=322.58 A-87.68,r2=0.919 9。

3.3 微球載藥量、包封率及體外釋藥行為

5批次測定結果見表1。bFGF-PLGA緩釋微球載藥量和包封率平均值分別為(59.9×10-3)%和79.9%,微球的突釋率均值為20.0%。微球在45 d內(nèi),能夠持續(xù)釋放bFGF,且釋放濃度比較穩(wěn)定。將上述5批試樣混合后經(jīng)檢測,45 d微球中bFGF的累積釋放率達80%。bFGF微球的體外釋藥曲線也顯示,bFGF-PLGA緩釋微球能夠體外持續(xù)釋藥,具有明顯的緩釋作用(圖2)。

表1 bFGF-PLGA緩釋微球載藥量、包封率和突釋率Tab.1 Drug loading amount,encapsulation efficiency and initial burst release percentage of bFGF-PLGA microspheres

圖2 bFGF-PLGA微球的體外釋藥曲線Fig.2 In vitro release profile of bFGF-PLGA microspheres

4 討 論

bFGF作為一種廣泛存在于人體各組織中但含量極微的生物活性物質(zhì),主要作用于中胚層組織與神經(jīng)外胚層組織和細胞,能夠促進多種細胞分裂增值,促進微血管分化,使局部毛細血管增加,改善血液循環(huán),刺激骨細胞DNA合成和增值,增加骨細胞合成膠原和非膠原蛋白的能力,誘導胚胎發(fā)育[6]。因此,bFGF能夠有效地促進骨、軟骨、肌腱、皮膚、血管、韌帶和中樞神經(jīng)等多種組織的創(chuàng)傷修復;并且與腫瘤的生長、增殖及一些神經(jīng)性系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系[7]。

本研究制備的bFGF-PLGA緩釋微球,使其在創(chuàng)傷初期修復階段,持續(xù)在組織局部釋放bFGF,并維持在有效生理濃度,以顯著促進創(chuàng)傷組織修復。本研究以PLGA為載體材料,應用單因素設計+正交設計進行bFGF微球制備工藝優(yōu)化,結果顯示,bFGF-PLGA緩釋微球表面光滑圓整,球體均勻性較好,微球凍干后呈疏松白色粉末,再分散性良好,可在常規(guī)條件下進行分裝。

一般認為,緩釋制劑在突釋期內(nèi)釋放的藥物量應占總量的20%左右,且藥物釋放曲線平滑,沒有過大的波動[8]。本研究顯示,微球的體外釋藥規(guī)律符合Higuichi方程,突釋率均值為20.0%,45 d后累積釋放量達到80%,且其濃度保持在一定的水平。因此,在45 d內(nèi)bFGF微球體外緩釋作用明顯,并且釋出bFGF濃度變化不大,實驗結果比較理想。

總之,本研究所制備的bFGF-PLGA緩釋微球有望發(fā)展成為一種具有對bFGF進行中長期緩釋功能的藥物載體,為研制符合臨床治療需要的中長效注射劑提供實驗依據(jù)。同時,若bFGF-PLGA緩釋微球引入支架材料,將有效促進血管化[9-10],在組織工程研究領域具有廣闊的應用前景。

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