石杜娟,徐元宏,胡元生,周銀娣,劉麗麗,鐘政榮,羅慶禮,沈繼龍

2.安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科,合肥 230061;

3.安徽醫(yī)科大學(xué)人獸共患病研究所,合肥 230032;

血吸蟲病是我國現(xiàn)階段沿江地區(qū)面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一。目前我國血吸蟲病流行區(qū)包括了沿江7個省,至少有約3 000萬人受血吸蟲病的威脅〔1-3〕。我國為日本血吸蟲病流行區(qū),也是血吸蟲病危害最嚴重的4個國家之一〔4〕。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是兒茶酚胺(Catecholamine,CA)類物質(zhì)合成過程中的限速酶〔5-6〕,T H通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程催化絲氨酸產(chǎn)生多巴胺,腎上腺素,去甲腎上腺素等兒茶酚胺類物質(zhì),調(diào)節(jié)血吸蟲蟲體肌肉的活動度及成蟲的產(chǎn)卵率〔6-7〕,可為血吸蟲病的分子干預(yù)環(huán)節(jié)、藥物開發(fā)、新型疫苗的設(shè)計和信號傳導(dǎo)通路干擾等研究開辟新途徑〔8〕。因此,通過研究 TH 的活性來調(diào)控CA 的合成,對日本血吸蟲的生長發(fā)育以及感染能力有很重要的意義,本研究通過 RACE PCR擴增出SjTH的編碼基因,并在真核表達系統(tǒng)中觀察其表達情況,為后續(xù)對CA調(diào)控的干擾來觀察日本血吸蟲的產(chǎn)卵率和致病情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 釘螺(江蘇血吸蟲病防治研究所);抗His標(biāo)簽單克隆抗體(購于北京普利來基因技術(shù)有限公司);TRIzol、DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine2000試劑(購于Invitrogen公司);DEPC(購于 Amresco公司);Ex Taq DNA聚合酶、dNTP 、DNA M arker(DL2000)、T-載體(pGEM-T Vector)、T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、NotI(購于TaKaRa公司);RT-PCR試劑盒(購于 Promega公司);小牛血清(杭州四季青);真核表達載體 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒;大腸桿菌XL1-blue、DH5a(安徽醫(yī)科大學(xué)人獸共患病研究所);質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒(購于AXYGEN公司)、醋酸纖維膜(Hybond-C Membrane購于 Amersham Biosciences公司)。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)本實驗室SjTH基因序列,用Primer5.0軟件設(shè)計出SjTH的引物序列如下：上游引物：5′-CGGAAT TCA TGCTTAACGTATGTGACAGAAACAC-3′(EcoR I);下 游 引 物：5′-CCGCGGCCGCTTAGTCACGATAT TCTATGCTAACAG-3′(NotI)。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 日本血吸蟲成蟲總RNA的提取 取出多條日本血吸蟲成蟲將其轉(zhuǎn)移入研缽中,加入T RIzol 1mL后研磨勻漿5min,再轉(zhuǎn)入 DEPC處理過的 1.5mL EP管中,置冰上10min;室溫孵育5min后,加0.5mL氯仿,用力振蕩15s后,室溫孵育3min,4℃12 000g 15min;再將上層液相轉(zhuǎn)移至新的EP中,加入0.5mL異丙醇,充分混勻,室溫孵育10min,4℃12 000g 10min;棄去上清液,在管中加 1mL的75%乙醇,漩渦振蕩混勻,4℃7 500g 5min;然后短暫干燥 RNA后,加 40μ L DEPC 溶解 RNA。

1.4 日本血吸蟲成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 參照Promega公司的RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),取5μ L聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.5SjTH基因原核亞克隆質(zhì)粒pGEM-T-SjTH的構(gòu)建上述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物SjTH按照DNA純化回收試劑盒說明進行PCR產(chǎn)物純化回收,回收后的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。將回收后的SjTH基因片段和pGEM-T載體用T4連接酶4℃連接過夜。制備感受態(tài)細胞XL1-blue,然后涂布于 LB/Amp/IPTG/X-gal平板,37℃培養(yǎng)過夜。挑取6個白色菌落,置于LB/Amp液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,用試劑盒小量提取質(zhì)粒DNA(pGEM-T-SjT H),經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,正確的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T-SjT H。重組基因的核苷酸由上海華大基因公司進行測序。

1.6SjTH基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 分別對pGEM-T-SjTH質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒進行EcoR I和NotI雙酶切,并按照DNA純化回收試劑盒說明,切膠純化酶切的pGEM-T-SjT H小片段SjTH和pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒大片段。將pcDNA3.1(+)載體與SjT H片段用Solution I 4℃連接過夜。制備感受態(tài)細胞DH5a,然后涂布于LB/Kana平板,37℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取4個白色菌落,置于LB/Kana液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,用試劑盒提取質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1(+)-SjTH),經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后,進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,鑒定后送上海華大基因公司進行測序。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-SjTH。

1.7 pcDNA3.1(+)-SjTH轉(zhuǎn)染入COS-7細胞及SjTH蛋白的表達與鑒定 將凍存的COS-7細胞復(fù)蘇后用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),3d換液1次,傳代3～4次使細胞達到良好的生長狀態(tài)。轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的COS-7細胞,再以無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,并按5×105∕ L密度接種于6孔板培養(yǎng)皿中,37℃5%CO2培養(yǎng)至細胞融合度為60%～80%。取1.5mL的 EP管,加入2μ g純化后的無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)-SjTH),溶于 100μ L無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,混勻后室溫放置30min即為A液。取10μL Lipofectamine2000溶于 100μ L無血清無雙抗的DM EM培養(yǎng)基中,混勻后室溫放置30min得到B液。將A、B液混勻,置室溫下孵育15min以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。同時從 6孔板培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基,用無血清的DM EM培養(yǎng)基輕輕沖洗待轉(zhuǎn)染的COS-7細胞一遍,加入800μ L的無血清 DMEM培養(yǎng)基。再將200μ L的AB混合液逐滴加入孔中,輕輕搖動培養(yǎng)板使其混勻。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5h后更換含有血清和雙抗的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時,設(shè)置正常的COS-7細胞和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)為對照。轉(zhuǎn)染48h后,改用含800μ g/mL G418、10%小牛血清的高糖 DMEM 篩選培養(yǎng)液培養(yǎng),每3d換液 1次,直至出現(xiàn)成團生長的轉(zhuǎn)染細胞集落。收集部分細胞進行 RTPCR和Western blot鑒定。

2 結(jié) 果

2.1SjTH編碼基因的擴增結(jié)果 RACE PCR擴增SjTH 3′和5′末端,測序,拼接預(yù)測編碼基因序列,再次擴增完整的編碼序列,亞克隆入pGEM-T載體,測序證實SjTH編碼基因有1 392bp。結(jié)果見圖1。

2.2 原核克隆載體pGEM-T-SjT H的構(gòu)建及鑒定原核目的基因連接入原核克隆載體pGEM-T后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-blue原核,挑選 4個克隆,PCR篩選出3個陽性克隆。2號克隆經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切鑒定,見圖2。

2.3 真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjTH的構(gòu)建及鑒定 真核目的基因連接入真核表達載體pcDNA3.1(+)后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a,挑選4個克隆,PCR結(jié)果4個都為陽性克隆。2號克隆經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切鑒定見圖2。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 SjTH cDNA及推測的相應(yīng)SjTH蛋白氨基酸序列注：經(jīng)RACE PCR可知SjTH的開放讀碼框(ORF)從A TG到TAA總共1 392bp,可生成463個氨基酸,用線畫的兩條信號肽是經(jīng)鑒定的氨基酸序列。Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequence of Schistosoma japonicum tyrosine hydroxylaseThe ORF of SjTH originated from ATG and ended in TAA for 1 392bp obtained by RACE PCR,463 amino acids were deduced.Two signal peptides underlined with lines were identified in the amino acid sequnece

2.4SjT H蛋白的真核表達及鑒定 將轉(zhuǎn)染真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjT H后的COS-7細胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)和正常的COS-7細胞進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)見圖3。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染真核表達載體 pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞處出現(xiàn)陽性條帶,說明轉(zhuǎn)染成功。

2.5SjT H基因在COS-7細胞中的表達 將轉(zhuǎn)染真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)和正常的COS-7細胞進行Western blot鑒定。結(jié)果顯示只有轉(zhuǎn)染真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjT H后的COS-7細胞處出現(xiàn)陽性條帶,說明有目的基因表達,見圖4。

3 討 論

兒茶酚胺(CA)類是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳輸?shù)纳窠?jīng)遞質(zhì),作為激素釋放的腎上腺素和去甲腎上腺素具有交感神經(jīng)興奮心血管及促進能量代謝作用。酪氨酸羥化酶催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)化成L-多巴,它是兒茶酚胺類合成過程中的限速酶,在CA的神經(jīng)傳遞和激素作用的過程中起著核心作用〔9〕。編碼T H的基因已經(jīng)從大部分的哺乳動物和其他脊椎動物中分離出來〔10〕。據(jù)報道：寄生蠕蟲有芳香族氨基酸羥化酶,并且曼氏血吸蟲可以用像高級生物那樣用同樣的酶反應(yīng)途徑合成它們自己的內(nèi)源性CA〔11〕。而CA合成的第一步就需要被TH催化,這種酶可以使酪氨酸轉(zhuǎn)換為短暫存在的中間產(chǎn)物L(fēng)-多巴。L-多巴經(jīng)過多步酶聯(lián)反應(yīng),很快依次代謝產(chǎn)生多巴、去甲腎上腺素和腎上腺素。TH催化這個途徑的第一個限速反應(yīng)并控制CA產(chǎn)生速度。SjTH長1 392bP,分子量54kD.TH通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程催化絲氨酸產(chǎn)生兒茶酚胺類物質(zhì),調(diào)節(jié)血吸蟲蟲體肌肉的活動度及成蟲的產(chǎn)卵率?，F(xiàn)已知在人體,可以通過維甲酸受體上游的啟動子從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)T H的基因表達〔12〕,酪氨酸羥化酶表達下降則可直接引起兒茶酚胺合成下降。本研究借鑒前人對曼氏血吸蟲SmT H的研究來探討日本血吸蟲 TH的功能。在曼氏血吸蟲中,目前已有實驗結(jié)果證明SmTH有以下特點：①在結(jié)構(gòu)和催化活性上同哺乳動物相似;②重組表達的曼氏血吸蟲 T H有兩種亞型,含有465個氨基酸,分子量為54kD;③純化的酶活性需有與哺乳動物相同的輔助因子四氫生物喋玲;④受產(chǎn)物負反饋調(diào)節(jié);⑤兒茶酚胺類物質(zhì)在蟲體內(nèi)與5-羥色胺(5-H T)相互作用,影響蟲體的肌肉收縮和成蟲的產(chǎn)卵率〔12〕;⑥體內(nèi)多種信號蛋白如14-3-3蛋白可通過蛋白質(zhì)間的相互作用激活磷酸化的TH產(chǎn)生多巴胺等 CA類物質(zhì)〔13〕,CDK11p110和CK2通過14-3-3蛋白結(jié)合到T H Ser19,降低了磷酸化的TH去磷酸化速率而負性調(diào)節(jié)TH生物學(xué)活性〔14〕。

圖4 轉(zhuǎn)染后目的蛋白SjTH的Western Blotting和SDSPAGE鑒定M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1和 2：轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞Western blot;3：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞SDS-PAGE;4：正常的 COS-7細胞SDS-PAGE;5：純化后的 SjTH蛋白Fig.4 Identification of the expression of the protein SjTH after trasfection pcDNA3.1(+)-SjTH in COS-7 cells by Western Blotting and SDS-PAGEM ：protein marker;1～ 2：Identification by Western blot;3：Identification by SDS-PAGE;4：the normal COS-7 cells;5：The protein SjTH after purification

本實驗的意義就在于通過重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjTH,將其轉(zhuǎn)染入COS-7細胞中,獲得有活性的SjTH蛋白。以繼續(xù)研究SjTH蛋白酶的活性,以及是否與曼氏血吸蟲中的T H一樣,14-3-3蛋白能否通過蛋白質(zhì)間的相互作用激活磷酸化的TH產(chǎn)生多巴胺等CA類物質(zhì),并且通過對酪氨酸羥化酶信號通路上游分子Sj14-3-3信號蛋白的干預(yù),調(diào)控酶活性,影響兒茶酚胺類物質(zhì)的合成,以抑制血吸蟲肌肉的興奮性和降低成蟲的產(chǎn)卵率,減弱其對血管的吸附能力及減少蟲卵負荷,為血吸蟲經(jīng)基因沉默的生物治療尋找新的途徑。

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