陳 玲，唐傳核，張業(yè)輝

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

菜豆屬豆類(lèi)蛋白酶促凝膠性能比較研究

陳 玲，唐傳核，張業(yè)輝

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

研究比較蕓豆(KPI)、紅豆(RPI)和綠豆(MPI)3種菜豆屬類(lèi)分離蛋白和大豆分離蛋白(SPI)在微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase)作用下的凝膠性能，并對(duì)其凝膠形成機(jī)理加以分析。SDS-PAGE電泳和哈克流變分析結(jié)果表明：菜豆類(lèi)分離蛋白是MTGase的良好作用底物，初始成膠所需時(shí)間：KPI＜MPI＜SPI＜RPI。而酶反應(yīng)后的凝膠G′值：RPI＞MPI＞KPI＞SPI，即KPI形成凝膠最快，而RPI最終成膠的強(qiáng)度最大；通過(guò)對(duì)不同溶劑下膠體溶解性的比較發(fā)現(xiàn)，除了酶共價(jià)交聯(lián)外，靜電相互作用，疏水作用及氫鍵都是形成凝膠的主要作用力，由于菜豆屬類(lèi)蛋白主要富含7S球蛋白(不含二硫鍵)，二硫鍵對(duì)其凝膠的穩(wěn)定性作用不如SPI明顯。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；菜豆屬；蛋白凝膠；流變學(xué)特性

由于在營(yíng)養(yǎng)上的重要性，植物蛋白質(zhì)，尤其是在種子中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，多年來(lái)已成為廣泛研究的課題。目前國(guó)內(nèi)的研究主要集中在大豆蛋白上。隨著世界人口的不斷增加，人類(lèi)的食品資源將進(jìn)一步緊張起來(lái)，而我國(guó)又是一個(gè)蛋白質(zhì)資源相對(duì)貧乏的國(guó)家，將大量廉價(jià)的菜豆屬類(lèi)蛋白轉(zhuǎn)化為人類(lèi)優(yōu)質(zhì)的食品蛋白源有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。紅豆、蕓豆、綠豆蛋白這3種菜豆屬類(lèi)的蛋白，已經(jīng)被證明有良好的營(yíng)養(yǎng)和功能特性[1-4]。這3種蛋白主要富含7S豌豆球蛋白(vicilin)，它是以非共價(jià)鍵結(jié)合的三聚體糖蛋白形式存在，其分子質(zhì)量達(dá)到150～250kD[5-6]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)，全稱(chēng)為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶，是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。它通過(guò)在蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成ε-(γ-谷氨酰)賴(lài)氨酸共價(jià)鍵，使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)形成高彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而改變食品的組織結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。目前，針對(duì)蛋白質(zhì)在TGase誘導(dǎo)下發(fā)生膠凝的研究已相當(dāng)廣泛[7-10]。然而TGase對(duì)菜豆屬類(lèi)蛋白的交聯(lián)作用卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)對(duì)菜豆屬類(lèi)(蕓豆、紅豆、綠豆)分離蛋白在微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase)誘導(dǎo)下形成凝膠的流變學(xué)性能加以分析，并與大豆分離蛋白比較，以期為菜豆屬蛋白資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蕓豆分離蛋白(KPI)、紅豆分離蛋白(RPI)、綠豆分離蛋白(MPI)、大豆分離蛋白(SPI) 自制。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase，其純化及酶活測(cè)定，具體見(jiàn)文獻(xiàn)[11]) 日本味之素公司贈(zèng)送；甘氨酸、Na2EDTA、尿素、SDS、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

RS 600流變儀 德國(guó)哈克公司；22PC分光光度儀上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 豆類(lèi)分離蛋白的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法，稍加改動(dòng)，提取分離蛋白。取100g脫脂豆粉溶于蒸餾水中(按1:15(g/mL)的比例)，攪拌1h，用2mol/L NaOH調(diào)pH值至8.0，繼續(xù)攪拌2h。然后離心(8000×g，30min，4℃)收集上清液。待溫度到達(dá)室溫時(shí)，用2mol/L HCl調(diào)pH值到4.5，攪拌1h，再離心(5000×g，20min，4℃)，收集沉淀。復(fù)溶于蒸餾水中，用2mol/L NaOH調(diào)pH值至7.5，攪拌直至蛋白質(zhì)充分溶解。透析24h，冷凍干燥，即得到分離蛋白樣品。蕓豆，紅豆，綠豆以及大豆分離蛋白均按上述方法和條件制備。

1.3 MTGase酶聚合反應(yīng)

適量分離蛋白樣品(KPI、MPI、RPI和SPI)分別溶于0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，配制成質(zhì)量濃度為2g/100mL的蛋白質(zhì)溶液，然后添加MTGase(20U/g蛋白)，于37℃下反應(yīng)不同時(shí)間(0～240min)，直接取樣與電泳樣品緩沖液混合(終止酶反應(yīng))，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.4 SDS-PAGE分析

根據(jù)Laemmli[13]的方法，在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)上進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，采用體積分?jǐn)?shù)12%的分離膠和體積分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠。電泳之前，酶反應(yīng)混合物直接與樣品緩沖液以相同體積混合，于沸水中加熱處理5min。溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠之前，設(shè)置電流為40mA，之后為80mA。凝膠染色液采用含有0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250，脫色采用高含量甲醇的醋酸溶液(甲醇、醋酸、水的體積比為227:37:236)。凝膠染色以及脫色后，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理，同時(shí)進(jìn)行光密度掃描分析。

1.5 小振幅動(dòng)態(tài)振蕩測(cè)量

動(dòng)態(tài)黏彈流變實(shí)驗(yàn)于RS 600流變儀中進(jìn)行，所采用的平行板直徑為27.83mm。樣品分散液置于平行板之間，其間隙設(shè)置為1mm。除去過(guò)量的樣品，并在樣品裸露周?chē)砑右槐庸杌?，以防止水分蒸發(fā)。隨著反應(yīng)時(shí)間的變化，記錄下彈性模量(G′)、損耗模量(G″)以及相角(δ)等各參數(shù)值。為了確保所有測(cè)量是在線(xiàn)性黏彈范圍內(nèi)進(jìn)行的，首先要在剪切振蕩頻率(f)=0.1Hz時(shí)進(jìn)行第一次剪切應(yīng)力范圍掃描。

酶促凝膠樣品處理：適量分離蛋白樣品(K P I、MPI、RPI、SPI)溶于 0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，配制成質(zhì)量濃度為7g/100mL的蛋白溶液，然后添加MTGase(20U/g蛋白)，立即裝載于流變儀的平臺(tái)，于37℃恒溫下連續(xù)記錄G′、G″、δ(或tanδ)隨酶反應(yīng)時(shí)間(0→360min)的參數(shù)值動(dòng)態(tài)變化。1.6 膠體溶解性測(cè)定

根據(jù)Luapano等[14]的方法，將分離蛋白(KPI、MPI、RPI、SPI)凝膠樣品溶于不同溶劑中：1)蒸餾水；2)pH 8.0的緩沖溶液(0.086mol/L Tris+0.09mol/L甘氨酸+ 4mmol/L Na2EDTA)(B)；3) pH8.0的緩沖溶液+0.5g/100mL的SDS+8mol/L尿素(BSU)；4)pH8.0的緩沖溶液+0.5 g/100mL的SDS+8mol/L尿素+體積分?jǐn)?shù)1%的β-巰基乙醇(2-ME)(BSUM)。凝膠樣品經(jīng)高速均質(zhì)(10000r/min，1min)處理，然后離心(15000×g，20min)，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)上清液的紫外吸光度，并以相應(yīng)的溶劑作空白對(duì)照，所有數(shù)據(jù)取3次的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豆類(lèi)分離蛋白的蛋白質(zhì)含量及亞基組成電泳分析

通過(guò)凱氏定氮法測(cè)得4種豆類(lèi)分離蛋白(K P I、MPI、RPI、SPI)的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為86.5%、92.1%、89.3%、89.4%(N質(zhì)量×6.25)，其亞基組成電泳分析如圖1。KPI、MPI、RPI這3種菜豆屬類(lèi)蛋白在分子量45kD附近處存在著明顯的泳帶。對(duì)比還原和非還原條件下45kD處譜帶遷移率基本上沒(méi)有變化，表明它是一種典型的Vicilin-like球蛋白(7S球蛋白)。一般而言，7S是一種不含二硫鍵的糖蛋白，通常以非共價(jià)結(jié)合成三聚體甚至四聚體。而SPI主要由11S(大豆球蛋白)和7S(β-伴大豆球蛋白)組成，11S亞基中含較多地二硫鍵，因此SPI在還原和非還原的電泳圖上呈現(xiàn)出不同的亞基分布。

圖1 KPI、MPI、RPI和SPI的SDS-PAGE電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of protein isolates (KPI, MPI, RPI and SPI)

2.2 酶交聯(lián)聚合反應(yīng)的SDS-PAGE電泳分析

M TG a se酶交聯(lián)聚合不同豆類(lèi)分離蛋白(KPI、MPI、RPI、SPI)的SDS-PAGE電泳分析如圖2所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，7S球蛋白組分含量不斷減少而聚合物(P)分子量不斷增大，不能進(jìn)入分離膠的聚合物越來(lái)越多，從而在濃縮膠頂部大量聚集。MTGase催化豇豆蛋白[15]、酪蛋白[16]、乳清蛋白[17]都得到了類(lèi)似的結(jié)果。

不同分離蛋白生成的聚合物的量和速度都不同，這與其蛋白分子亞基組成有關(guān)。比較圖2A～圖2D，KPI、MPI、RPI、SPI在MTGase誘導(dǎo)下的酶促凝膠過(guò)程表現(xiàn)出一定的相似性，在15min后濃縮膠上層就出現(xiàn)了大量的聚合物。在聚合反應(yīng)的過(guò)程中，SPI中11S的酸性亞基和堿性亞基的貢獻(xiàn)不同。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酸性亞基慢慢減少，新聚合物也在濃縮膠部分出現(xiàn)，而堿性亞基在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中卻沒(méi)有多大變化，觀察的結(jié)果與文獻(xiàn)[18]類(lèi)似，機(jī)理可能是堿性亞基包埋在11S球蛋白內(nèi)部，酶反應(yīng)的活性區(qū)域很難與其接觸。通過(guò)電泳分析，發(fā)現(xiàn)富含7S球蛋白的菜豆屬類(lèi)蛋白是MTGase的良好作用底物，7S亞基主要參與了酶反應(yīng)的過(guò)程，由于亞基組成的不同，大豆分離蛋白與其呈現(xiàn)出不同的聚合反應(yīng)性質(zhì)。

圖2 MTGase酶交聯(lián)聚合反應(yīng)的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of MTGase-induced gels from protein isolates (KPI, MPI, RPI and SPI)

2.3 MTGase誘導(dǎo)凝膠動(dòng)力學(xué)分析

圖3為KPI、MPI、RPI和SPI在MTGase誘導(dǎo)下形成凝膠的動(dòng)態(tài)過(guò)程。經(jīng)最初的恒溫反應(yīng)一段時(shí)間后，G'值快速增大，360min后達(dá)到一個(gè)較高的相對(duì)穩(wěn)定值，這表明在MTGase作用下蛋白質(zhì)分子間共價(jià)交聯(lián)程度不斷提高，逐漸形成了穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。分析G'和G〞的變化，發(fā)現(xiàn)不同分離蛋白之間凝膠形成過(guò)程有所不同。根據(jù)一般凝膠形成信號(hào)(G'＞G〞)判定，最初成膠所需時(shí)間(tgel)：KPI＜MPI＜SPI＜RPI，即KPI在MTGase催化下形成凝膠所需時(shí)間最短，而RPI成膠則相對(duì)緩慢。G′不僅反應(yīng)了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成還在一定程度上表征了蛋白凝膠強(qiáng)度的變化[19]。如圖4所示，在初始反應(yīng)的30min里，G′從0增大到300Pa，此時(shí)的凝膠很弱，反映不出蛋白之間的差異性。經(jīng)240min的恒溫反應(yīng)后，G′值顯著增加，表明在MTGase的作用下蛋白凝膠強(qiáng)度明顯提高。360min之后，根據(jù)G′值的不同，蛋白之間的成膠性能差異非常顯著，比較最后形成的凝膠G′值：RPI＞MPI＞KPI＞SPI。值得一提的是，RPI在整個(gè)恒溫反應(yīng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化最明顯，雖然成膠最慢但最終形成的凝膠強(qiáng)度卻最大。

圖 4 MTGase酶促KPI、MPI、RPI和SPI凝膠的G'值比較Fig.4 Comparison Nababanat moduli (G′) value of protein isolates (KPI, MPI, RPI and SPI ) incubated with MTGase

2.4 MTGase酶誘導(dǎo)凝膠的膠體溶解性

根據(jù)文獻(xiàn)[13]，蛋白凝膠在不同溶劑中的溶解性反映了不同分子作用力在形成凝膠結(jié)構(gòu)中的貢獻(xiàn)，如靜電相互作用、非共價(jià)鍵(疏水相互作用和氫鍵)以及二硫鍵。本研究中由MTGase誘導(dǎo)的共價(jià)鍵交聯(lián)也應(yīng)予以考慮。表1反映了MTGase酶促凝膠在不同溶劑中的溶解性。在蒸餾水中，KPI和SPI均有50%左右的溶解性，而MPI為34.32%，RPI為23.10%。這與前面流變學(xué)分析的結(jié)果一致，因?yàn)槊附宦?lián)形成的共價(jià)鍵不易被破壞，特別是RPI，交聯(lián)的程度最大，因此在水中的溶解性最差。蛋白凝膠在緩沖液(B)和蒸餾水中的溶解性不同，反映了靜電作用力參與凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的情況。除了KPI，另3種凝膠在B的溶解性均比在蒸餾水中要好，反映了靜電作用力參與了SPI和RPI凝膠網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成，而KPI分子中的靜電作用力剛好相反，降低了它在緩沖液(B)中的溶解性。在緩沖液中添加變性劑尿素(BSU)，KPI、MPI和RPI的凝膠的溶解性均明顯增大，由此可見(jiàn)，除酶交聯(lián)形成的共價(jià)鍵以外，非共價(jià)鍵(疏水相互作用和氫鍵)也是參與菜豆屬類(lèi)分離蛋白酶促凝膠形成的主要作用力。進(jìn)一步添加2-ME(BSUM)，蛋白凝膠溶解地更完全，SPI的變化最大。這種變化與蛋白質(zhì)分子的亞基組成有關(guān)。菜豆屬蛋白富含7S球蛋白，是一種不含二硫鍵的糖蛋白，而SPI主要含有11S和7S亞基，11S亞基中含較多地二硫鍵，2-ME的存在破壞了二硫鍵，更有利于其溶解。然而B(niǎo)SUM并未100%地溶解蛋白質(zhì)膠體，說(shuō)明仍存在共價(jià)交聯(lián)的部分不易被溶劑所破壞。

表1 MTGase酶促蛋白凝膠在不同溶劑中的膠體溶解性Table 1 Solubility of MTGase-induced gels in various solvents

3 結(jié) 論

以上研究表明，不同豆類(lèi)蛋白質(zhì)在MTGase的作用下凝膠性能不同。菜豆屬類(lèi)蛋白(KPI、MPI和RPI)是MTGase的良好底物，且成膠性能優(yōu)于SPI。這為菜豆屬類(lèi)蛋白資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了廣泛的應(yīng)用前景。比較4種豆類(lèi)分離蛋白，初始成膠所需時(shí)間：KPI＜MPI＜SPI＜RPI。而酶反應(yīng)后的凝膠G′值：RPI＞MPI ＞KPI＞SPI。KPI成膠所需時(shí)間最短，RPI成膠強(qiáng)度最大；RPI在整個(gè)酶促凝膠過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化最大。通過(guò)對(duì)不同溶劑下膠體溶解性的比較發(fā)現(xiàn)，除了酶共價(jià)交聯(lián)外，靜電相互作用，疏水作用及氫鍵都是形成凝膠的主要作用力，二硫鍵對(duì)對(duì)菜豆屬蛋白凝膠的穩(wěn)定性作用不如SPI明顯。

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Enzymatic-induced Gelation Properties of Protein Isolates from Phaseolus

CHEN Ling，TANG Chuan-he，ZHANG Ye-hui
(College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Microbial transglutaminase-induced (MTGase) gelation properties of protein isolates from red kidney bean, red bean,mung bean and soybean (designated as KPI, RPI, MPI and SPI) were investigated. SDS-PAGE analysis and dynamic oscillatory measurement indicated that the time needed to gelation onset (tgel) exhibited a following order, KPI＞MPI＞SPI＞RPI, whereas the order of G′ value after MTGase incubation was RPI＞MPI＞KPI＞SPI. Protein solubility analysis of MTGase-induced gels suggested that electrostatic interaction, hydrophobic interaction and hydrogen bonds except covalent bonds were the primary forces responsible for the formation of gels. In addition, disulfide bonds were also involved in gelation. Therefore,compared to SPI, the effects of protein isolates from Phaseolus on gelation stability were less obvious due to the devoid of disulfide bonds among individual subunits in protein isolates from Phaseolus.

Microbial transglutaminase-induced；Phaseolus；protein gel；rheological measurement

TS201.7

A

1002-6630(2010)09-0062-05

2009-10-11

陳玲(1985—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白質(zhì)工程。E-mail：ling.c@mail.scut.edu.cn