陳 濤 ，張 健 ，王茂劍 ,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋水產(chǎn)研究所，山東 煙臺 264006)

木瓜蛋白酶提取仿刺參消化道多糖

陳 濤1,2，張 健2，王茂劍2,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋水產(chǎn)研究所，山東 煙臺 264006)

采用酶解法提取仿刺參消化道多糖并進(jìn)行初步性質(zhì)測定。方法：通過木瓜蛋白酶酶解獲得粗多糖，并綜合考慮酶解時間、溫度、加酶量的影響，獲得優(yōu)化的酶解條件；采用三氯醋酸法除蛋白，Sephacryl S-400凝膠柱層析進(jìn)行純化，并測定其相對分子質(zhì)量和硫酸基含量。結(jié)果：酶解最佳條件為加酶量10400U/g，酶解溫度55℃，酶解時間6h，多糖得率8.11‰；純化多糖為組分單一的酸性多糖，分子質(zhì)量約25kD，硫酸基含量約為9.29%。

仿刺參消化道多糖；分離；純化

仿刺參(Apostichopus japonicus)屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)，其生存已有5000萬年之久[1]，不僅美味可口，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)，另有少量核酸和多種無機(jī)成分。海參多糖因其具有抗腫瘤、抗凝血、提高免疫力等多種活性[2]，一直是海參深加工的重點研究方向之一；但以往研究只局限于海參體壁，而將海參腸道作為廢棄物。本研究以仿刺參腸道多糖作為研究對象，主要研究其分離純化方法，并對其性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步促進(jìn)深加工和綜合利用這一珍貴的海洋生物資源提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮參腸，產(chǎn)地山東東營。

Sephacryl-S400-HR填料 Ge-healthcare公司；木瓜蛋白酶 Sigma公司；D-葡萄糖 北京拜爾迪生物公司；苯酚、三氯醋酸、醋酸鉀、硫酸、葡聚糖等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R 高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī) 日本東京理化器械株式會社；TU-1810PC紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 消化道多糖的提取

取參腸，洗凈后用篩瀝水至沒有水滴下，投入組織搗碎機(jī)搗碎，勻漿，稱取30g。加入木瓜蛋白酶，置于恒溫水浴鍋中酶解。酶解完成后取出酶解液，90℃水浴中加熱15min滅酶，7000r/min離心15min[3]，棄去沉淀，取上清液即為粗多糖溶液。酶解過程以不同的酶解溫度、酶解時間、加酶量作為單因素試驗，以苯酚-硫酸法測其總糖含量[4]，并根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取因素水平進(jìn)行正交試驗。通過統(tǒng)計分析獲得多糖的最佳提取條件。

1.3.2 消化道粗多糖精制

將粗多糖溶液進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，取濃縮液加入1/2體積50% TCA溶液，靜止過夜[5-6]。再于10000r/min下離心15min，取上清液加入醋酸鉀使其濃度達(dá)到1.5mol/L，于4℃下靜置過夜[7]，離心得純化的多糖沉淀。將所得多糖加水復(fù)溶后，于紫外光譜下掃描。并將離心上清液同樣進(jìn)行掃描，檢驗多糖是否沉淀完全。

1.3.3 消化道多糖柱層析及相對分子質(zhì)量測定

取精制后消化道多糖2mL，10000r/min離心10min，取上清液過Sephacryl-S400-HR柱，以三蒸水洗脫，流速0.7mL/min，自動部分收集器收集洗脫液。層析后隔管檢測，以管號為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線[8]。根據(jù)收集液的光密度值合并單一峰。重復(fù)數(shù)次，將相同峰合并，濃縮干燥后稱質(zhì)量，得到純化消化道多糖(Apostichopus japonicusalimental tract polysaccharide，SAP)。

取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖，其分子質(zhì)量分別為1×104、7×104、50×104D，依次上柱洗脫，按其洗脫體積與相對分子質(zhì)量關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-11]。并取少量SAP溶于水后過柱，收集洗脫體積，計算相對分子質(zhì)量。

1.3.4 多糖硫酸基含量測定

采用氯化鋇-明膠比濁法[12]測多糖中硫酸基含量。并按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定樣品，計算取代度(DS)。

式中：S為樣品中硫的含量/%；n為單糖總數(shù)；162為多糖相對分子質(zhì)量；多糖分子中的1個－OH被取代后變?yōu)椋璒SO3Na，相對分子質(zhì)量增加值為102；32為S的相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，490nm處吸光度為縱坐標(biāo)，苯酚-硫酸法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度和葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系：y=0.0081x－0.0008，R2=0.9982。

2.2 仿刺參消化道多糖的提取因素分析

2.2.1 酶解時間對多糖提取的影響

取仿刺參消化道勻漿，每份30g，加木瓜蛋白酶至8000U/g，置于60℃下分別酶解1、2、4、6、8、10h。酶解完成后按1.3.1節(jié)操作，苯酚-硫酸法測得率，得圖1。

圖1 提取時間對吸光度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on polysaccharide extraction

如圖1所示，酶解時間從1h增加到6h，苯酚-硫酸法測得多糖吸光度顯著增大；從6h增大到8h，吸光度略有變化，通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析，變化值不顯著。說明多糖在此時已基本提取完全，時間再延長，吸光度也不會明顯增加。因此，最佳的酶解提取時間控制在6h左右。

2.2.2 酶解溫度對多糖提取的影響

取仿刺參消化道勻漿，每份30g，加木瓜蛋白酶至8000U/g，分別置于30、40、50、60、70、80℃下酶解6h。結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對吸光度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide extraction

從圖2可看出，酶解溫度從30℃增加到50℃，多糖吸光度顯著增大；從50℃增大到70℃，吸光度略有變化，但變化值不明顯；而從70℃再上升，多糖吸光度有下降趨勢。說明隨溫度上升，多糖得率逐漸提高，在60℃左右時達(dá)到最佳，此后溫度再上升，可能相對高溫對酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞而影響與底物結(jié)合，導(dǎo)致提取率下降[13]。因此，最佳酶解提取溫度控制在70℃以下，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，最佳提取溫度為50℃左右。

2.2.3 加酶量對多糖提取的影響

取仿刺參消化道勻漿，每份30g，分別加木瓜蛋白酶至 2000、4000、8000、12000、16000、20000U/g，置于60℃酶解6h。結(jié)果如圖3所示。

圖3 加酶量對吸光度的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on polysaccharide extraction

加酶量從2000U/g增加到8000U/g，多糖吸光度顯著增大；從8000U/g增大到20000U/g，吸光度變化不明顯。說明加酶量在8000U/g以前，底物沒有得到充分結(jié)合，而在8000U/g時底物蛋白基本結(jié)合完全，多糖得以完全釋放，再提高加酶量也很難提高得率。因此，最佳的加酶量為8000U/g。

2.2.4 多糖提取條件正交試驗

表1 多糖提取條件正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 多糖提取條件正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

為進(jìn)一步提高多糖得率，將單因素試驗獲得的各項最佳條件采用正交試驗加以優(yōu)化。按表1進(jìn)行正交試驗。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for polysaccharide yield with various hydrolysis conditions

通過方差分析可以看出，酶解溫度和加酶量對結(jié)果有顯著性的影響，綜合考慮各因素，仿刺參消化道多糖最佳提取條件：加酶量10400U/g，酶解溫度55℃，酶解時間6h，得率為8.11‰。

2.3 仿刺參消化道多糖的純化

粗多糖經(jīng)除蛋白，醋酸鉀沉淀后，進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 精制多糖紫外掃描圖Fig.4 UV-visible scanning spectrum of purified polysaccharide from Apostichopus japonicus alimental tract

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，多糖復(fù)溶液在260nm和280nm處均無吸收峰，說明樣品中不含核酸和蛋白等雜質(zhì)；在190～200nm有強(qiáng)烈單一吸收，為多糖類特征吸收峰，表明所提物質(zhì)為純化多糖[14]。在上清液掃描圖中，在190～200nm沒有吸收，表明多糖已沉淀完全。

2.4 仿刺參消化道多糖柱層析及分子質(zhì)量測定結(jié)果

2.4.1 多糖柱層析

圖5 精制多糖柱層析曲線Fig.5 Sephacryl S-400 column purification of purified polysaccharide from Apostichopus japonicus alimental tract

精制多糖經(jīng)過柱層析純化，分布比較集中，峰形單一對稱，說明分子質(zhì)量大小位于這一范圍內(nèi)的多糖被集中洗脫出，且不含雜質(zhì)。結(jié)果見圖5。

2.4.2 多糖相對分子質(zhì)量測定

通過標(biāo)準(zhǔn)樣品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=－5.9353x+61.26，R2=0.9973。依此計算得SPA分子質(zhì)量為25kD。

2.5 多糖硫酸基測定

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得－SO42－含量為9.29%，該多糖為一種酸性多糖。

3 討 論

選用木瓜蛋白酶提取仿刺參消化道多糖。木瓜蛋白酶不僅具有較寬的底物特異性，而且pH值應(yīng)用范圍廣，能更好地滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要；從粗多糖得率來看，達(dá)到了8‰，接近仿刺參體壁多糖含量，超過文獻(xiàn)[14]報道的得率。粗多糖經(jīng)除蛋白，柱層析純化可得到組分單一的多糖，分子質(zhì)量約25kD。

硫酸酯基在文獻(xiàn)報道中屬于聚陰離子[15]，其在多糖中的數(shù)量和位置對于發(fā)揮多糖生物學(xué)功能具有重要作用。仿刺參消化道多糖硫酸酯基含量超過9%，但低于文獻(xiàn)[16]所報道的體壁多糖硫酸基的含量，其取代基位置也需要做進(jìn)一步闡明，因此可以考慮對其進(jìn)行硫酸酯化，利用紅外光譜、質(zhì)譜或核磁共振等手段進(jìn)行更深層次的研究。

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Papain Hydrolysis for the Extraction of Polysaccharides fromApostichopus japonicusAlimental

CHEN Tao1,2，ZHANG Jian2，WANG Mao-jian2,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China；2. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province, Yantai 264006, China)

The enzymatic hydrolysis ofApostichopus japonicusalimental tract with papain was carried out for polysaccharide extraction, and the obtained polysaccharides were preliminarily characterized. Three hydrolysis parameters including hydrolysis time and temperature as well as enzyme amount were optimized. The relative molecular mass and sulfate group content of the purified product of the crude extract obtained after deproteinization by Sevag method and subsequent Sephacryl S-400 gel filtration chromatography were measured. Enzyme amount of 10400 U/g, hydrolysis temperature of 55 ℃and hydrolysis time of 6 h were found optimal, and the polysaccharide yield was 8.1‰ under these hydrolysis conditions. After Sephacryl S-400 column purification, an acidic polysaccharide with single composition was obtained, and its relative molecular mass might be 25 kD and its sulfate group content was approximately 9.29%.

Apostichopus japonicusalimental tract polysaccharide；extraction；purification

TQ929.2

A

1002-6630(2010)20-0226-04

2010-06-30

國家海洋局海洋公益性行業(yè)重大科研專項(200805031)；

國家海洋局海洋經(jīng)濟(jì)規(guī)劃科技推進(jìn)平臺與運作項目(國?？谱?[2007]219))

陳濤(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：ct01019@163.com

*通信作者：王茂劍(1964—)，男，研究員，本科，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：wangmaojian@126.com