楊云裳，許建國，張應(yīng)鵬*，李春雷

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

酶法合成沒食子酸葉黃素酯的研究

楊云裳，許建國，張應(yīng)鵬*，李春雷

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

以葉黃素和沒食子酸為原料，在脂肪酶Novozym435的催化下，合成沒食子酸葉黃素酯，并用IR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。研究脂肪酶催化葉黃素與沒食子酸合成沒食子酸葉黃素酯的影響因素，考察酶量、溶劑、體系水分、溫度、時(shí)間等因素對(duì)酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，適宜的工藝條件為酶用量10mg/mL、溶劑為氯仿、初始加水量60mg/g、溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間30h，在上述條件下沒食子酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)81.8%。

沒食子酸；葉黃素；脂肪酶；酯化反應(yīng)

葉黃素分子中存在共軛雙鍵，共軛雙鍵對(duì)氧是極不穩(wěn)定的，特別是純的晶體更容易被氧化破壞。許多物理、化學(xué)、生物因素都影響到葉黃素的穩(wěn)定性，例如氧、光輻射、高溫、酸等[1]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，葉黃素在未避光保存條件下60d后其含量僅占原來樣品中45%，而暴露空氣中的葉黃素在60d后其葉黃素質(zhì)量占原來樣品中葉黃素質(zhì)量的9.7%，葉黃素的不穩(wěn)定性限制了其開發(fā)利用，文獻(xiàn)報(bào)道，葉黃素酯的生物利用度大于純?nèi)~黃素[3]。本實(shí)驗(yàn)把葉黃素與沒食子酸合成沒食子酸葉黃素酯，可以大大提高葉黃素的穩(wěn)定性，沒食子酸葉黃素酯在人體內(nèi)水解成葉黃素和沒食子酸，同時(shí)滿足人們對(duì)沒食子酸的需求。沒食子酸具有廣譜的抗菌、抗病毒、抗腫瘤[4]等藥理作用。

傳統(tǒng)化學(xué)方法合成沒食子酸葉黃素酯，存在反應(yīng)溫度高，不利于葉黃素的穩(wěn)定，而酶催化法具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外關(guān)于脂肪酶催化酯類合成的研究主要應(yīng)用在山梨醇油酸、蠟酯、VA乳酸酯和風(fēng)味酯[5]的合成。在合成葉黃素衍生物方面還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以沒食子酸、葉黃素作為底物，考察各因素對(duì)于酯化反應(yīng)的影響，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行摸索。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

固定化脂肪酶(Novozym435) 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；沒食子酸、氧化鎂、葉黃素、丙酮、乙醇、甲苯、氯仿、正己烷、石油醚均為分析純；分子篩(4A°) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠(100～200目、200～300目) 青島海洋化工有限公司。

THZ-92B氣浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AC-400核磁共振波譜儀 中科院武漢波譜公司；Nexus 670FT-IR型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DZF-6021真空干燥箱 上海中友儀器設(shè)備有限公司；FA1004電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沒食子酸葉黃素酯的合成[6]

準(zhǔn)確稱取葉黃素56mg(0.1mmol)和沒食子酸34mg(0.2mmol)(物質(zhì)的量的比為1:2)，置于10mL具塞錐形瓶中，加入1.0mL脫水的氯仿，然后加入10mg脂肪酶(Novozym435)，充入氮?dú)?，?0℃氣浴搖床下，避光振蕩反應(yīng)12h，然后加入15mg活化的4A°分子篩，再繼續(xù)反應(yīng)12h停止。

1.2.2 沒食子酸葉黃素酯的分離純化

在層析柱中裝入一層脫脂棉，并用石油醚潤濕沖實(shí)。稱取15g硅膠(200～300目)，15g氧化鎂，充分?jǐn)嚢枋箖烧呋旌暇鶆蚝蠹尤胫又校檬兔逊磸?fù)沖幾遍，使柱子中的硅膠和氧化鎂沖實(shí)加固。用移液管小心地將待分離的沒食子酸葉黃素酯移入玻璃皿中，然后稱取2g硅膠(100～200目)將其拌干，再加入柱子中。先用石油醚作為洗脫劑，由于沒食子酸葉黃素酯的極性較小，所以用石油醚就可以將它沖下，當(dāng)點(diǎn)樣無原料點(diǎn)下來時(shí)，換用石油醚:丙酮:甲醇=85:15:1(V/V)的溶劑作為洗脫劑繼續(xù)沖洗，點(diǎn)樣直到無點(diǎn)后，換用石油醚:丙酮=7:1的溶劑作為洗脫劑繼續(xù)沖洗。最后換用乙酸乙酯作為洗脫劑，直到柱子沖洗干凈后認(rèn)為沒食子酸葉黃素酯已全被沖下。收集沒食子酸葉黃素酯，濃縮即得。

1.2.3 沒食子酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

式中：m1、m2為反應(yīng)前、后的樣品質(zhì)量/mg；V1、V2為反應(yīng)前、后滴定所用氫氧化鈉的量/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸葉黃素酯的合成及分離純化

在有機(jī)介質(zhì)中，脂肪酶的催化具有專一性和特異性[7]，催化沒食子酸分子與葉黃素分子直接進(jìn)行酯化反應(yīng)。沒食子酸葉黃素酯得率81%。

2.2 沒食子酸葉黃素酯的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 沒食子酸葉黃素酯的紅外(IR)分析

對(duì)硅膠柱層析分離純化得到的沒食子酸葉黃素酯作紅外分析，結(jié)果見圖1。3448cm-1處的強(qiáng)吸收峰為沒食子酸上－OH的吸收峰，1713cm-1處的強(qiáng)吸收峰為酯C=O的伸縮振動(dòng)峰[8]，是酯的特征吸收峰。以上分析說明，沒食子酸和葉黃素在脂肪酶的催化下已經(jīng)發(fā)生酯化反應(yīng)，生成了沒食子酸葉黃素酯。

圖1 沒食子酸葉黃素酯的紅外圖譜Fig.1 IR spectrum of gallic acid lutein ester

2.2.2 沒食子酸葉黃素酯的核磁H譜(400MHz，CDCl3)

由產(chǎn)物核磁H譜數(shù)據(jù)(圖2)可知，產(chǎn)物圖譜中6.968～7.521為沒食子酸苯環(huán)氫的化學(xué)位移，4.196為葉黃素結(jié)構(gòu)式上－CH=CH2氫的化學(xué)位移，證明產(chǎn)物中有沒食子酸和葉黃素結(jié)構(gòu)。

圖2 沒食子酸葉黃素酯的核磁H譜(1HNMR)圖譜Fig.2 1HNMR spectrum of gallic acid lutein ester

2.3 初始加水量對(duì)反應(yīng)的影響

圖3 初始加水量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of initial water content on conversion rate of gallic acid

水對(duì)脂肪酶的影響有兩個(gè)方面。一方面，酶需要少量的水以保持活性的三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)，水可以保持催化部位的整體性，催化部位的極化、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。另一方面，水含量過高，酶構(gòu)象柔性過大，酶構(gòu)象將向疏水環(huán)境下熱力學(xué)穩(wěn)定的狀態(tài)變化，引起酶結(jié)構(gòu)的改變和失活，同時(shí)又限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性。只有水量適宜時(shí)酶表現(xiàn)出最大活力[9]。多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加水量為60mg/g比較合適(圖3)。既保持酶活性的三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)又促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。

2.4 有機(jī)溶劑對(duì)反應(yīng)的影響

在使用不同的酶或者在不同的反應(yīng)體系中，最適于使用的有機(jī)溶劑也是不同的。有機(jī)溶劑影響酶催化的途徑有3種：一是有機(jī)溶劑與酶直接發(fā)生作用，通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活；二是有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的底物或產(chǎn)物相互作用，影響正常酶催化反應(yīng)的進(jìn)行；三是有機(jī)溶劑還可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般認(rèn)為在非水介質(zhì)中添加親水性或和水互溶性的有機(jī)溶劑對(duì)反應(yīng)不利，因?yàn)樗鼈儠?huì)奪取酶周圍微環(huán)境的必需水，從而使酶失活，所以選擇的有機(jī)溶劑疏水性越強(qiáng)越好[10]。由圖4可知，氯仿比較合適。

圖4 有機(jī)溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of organic solvent type on conversion rate of gallic acid

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion rate of gallic acid

固定化酶Novozym435在100℃仍保持較高的酶活性。為此，在其他條件不變的情況下，只改變反應(yīng)溫度觀察對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，具體結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示隨溫度的升高轉(zhuǎn)化率增加，但溫度過高(＞50℃)對(duì)葉黃素的穩(wěn)定不利[2]，實(shí)驗(yàn)表明40℃比較合適。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響見圖6，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而提高，但30h后轉(zhuǎn)化率的增長趨勢(shì)不明顯，可能由于反應(yīng)時(shí)間過長，酶的機(jī)械損耗增大，活力喪失，影響酯化反應(yīng)進(jìn)行[11]。所以總體時(shí)間應(yīng)控制在30h。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of reaction time on conversion rate of gallic acid

2.7 酶用量對(duì)反應(yīng)的影響

在葉黃素加量20.1mg、葉黃素與沒食子酸物質(zhì)的量的比1:2、加入氯仿1.0mL、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間24h條件下，考察酶用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 酶用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of enzyme load on conversion rate of gallic acid

由圖7可知，隨著酶用量增加，反應(yīng)速度加快，酯化率增高。但酶用量達(dá)10mg/mL后，酶用量進(jìn)一步增加，酯化率反而有降低的趨勢(shì)，這是由于過多的酶使反應(yīng)初始生成的副產(chǎn)物水增加，過多的水會(huì)使反應(yīng)向負(fù)反應(yīng)進(jìn)行，并且可能導(dǎo)致酶失活[12]。所以酶用量為10mg/mL較合適。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過酯化反應(yīng)，利用固定化脂肪酶催化葉黃素與沒食子酸合成沒食子酸葉黃素酯，并對(duì)影響此反應(yīng)的各種因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。反應(yīng)經(jīng)初步優(yōu)化得到的條件為酶用量10mg/mL、溶劑為氯仿、初始加水量60mg/g、溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間30h，在上述條件下沒食子酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)81.8%。

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Lipase-catalyzed Synthesis of Gallic Acid Lutein Ester

YANG Yun-shang，XU Jian-guo，ZHANG Ying-peng*，LI Chun-lei
(School of Petrochemical Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

Lutein and gallic acid were used as the raw materials to synthesize gallic acid lutein ester through the catalysis of Lipozyme Novo 435. The structure of the synthesized product was determined by IR. The effects of enzyme load, solvent, and water content, reaction temperature and reaction time on the esterification were investigated. The optimal reaction conditions were determined as follows: enzyme load, 10 mg/mL; water content, 60 mg/g; reaction medium, chloroform; reaction temperature,40 ℃; and reaction time, 30 h. The conversion rate of gallic acid was up to 81.8% under these conditions.

gallic acid；lutein；lipase；esterification

Q814

A

1002-6630(2010)20-0093-04

2010-01-04

楊云裳(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镉袡C(jī)化學(xué)。E-mail：yangguang@lut.cn

*通信作者：張應(yīng)鵬(1970—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)橛袡C(jī)化學(xué)。E-mail：yingpengzhang@126.com