裘雪梅，劉仁榮*，徐 玲，孟 瑋，涂 順，謝少霞

(江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013)

蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體的制備及其間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)

裘雪梅，劉仁榮*，徐 玲，孟 瑋，涂 順，謝少霞

(江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013)

重氮法合成蘇丹紅Ⅰ的結(jié)構(gòu)類似物，通過活性酯法將蘇丹紅Ⅰ的結(jié)構(gòu)類似物偶聯(lián)到載體蛋白上制備人工抗原，用所制備的人工抗原免疫BALB/c小鼠，采用細(xì)胞融合的方法制備蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體，結(jié)果成功篩選到一株抗蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體，經(jīng)鑒定為IgG2a型，并建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，線性范圍為0.5～10ng/mL，檢測(cè)下限為0.1ng/mL，加標(biāo)回收率為52.3%～110%，變異系數(shù)為3.2%～8.9%。

蘇丹紅Ⅰ；單克隆抗體；ELISA檢測(cè)

Abstract：A SudanⅠanalog was synthesized by diazotization and conjugated to bovine serum albumin (BAS) or keyhole limpet hemocyanin (KLH) by active ester method and a BAS based detection antigen and a KLH based immune antigen were obtained.A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established to detect the immunogenity of the immune antigen. BALB/c mice were immunized with the immune antigen for antibody generation. For the preparation of anti-SudanⅠmonoclonal antibodies, cell fusion was used. An indirect competitive ELISA assay was developed. A linear relationship was observed over the concentration range of 0.5 to 10 ng/mL and the detection limit was 0.1 ng/mL. The average recovery rates of SudanⅠin red hot chili pepper powder spiked at 6 different levels were between 52.3% and 110% with variation coefficients varying from 3.2% to 8.9%.

Key words：Sudan Ⅰ；monoclonal antibody；ELISA detection

蘇丹紅Ⅰ(Sudan Ⅰ)的化學(xué)名稱為1-苯基偶氮-2-萘酚，常作為工業(yè)染料，被廣泛用于如溶劑、油、蠟、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明蘇丹紅Ⅰ具有致癌性，可引起肝臟、膀胱和脾臟等臟器的腫瘤[1-4]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將蘇丹紅歸為三類致癌物，時(shí)同具有致敏性和遺傳毒性[5-6]。

目前，蘇丹紅Ⅰ的檢測(cè)方法主要是液質(zhì)聯(lián)用法和高效液相色譜法[7-8]，對(duì)儀器和操作人員要求較高，儀器投資大、效率低，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要。免疫學(xué)分析法是建立在抗原抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的分析方法，對(duì)樣品的純度要求較低，所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，靈敏度和特異性較高，適合于大批量樣本的檢測(cè)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值較高。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅辣椒 市售；雜交瘤細(xì)胞株(6B10)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

蘇丹紅Ⅰ、匙眼貝血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumen，BSA)、二環(huán)己基碳化二亞胺(dicylochexylcarbodiimide，DCC)、氮羥基琥珀酸(N-hydroxysuccinimide，NHS)、羰基二咪唑(1,1-carbonyldiimidazole，CDI)、ε-氨基己酸、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑和羊抗小鼠酶標(biāo)二抗 Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-205紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；微量移液器、K185紫外透射反射儀、酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物的合成與鑒定

采用重氮法合成蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物1-(4-羧基苯基)偶氮-2-萘酚，化學(xué)反應(yīng)原理見圖1，具體步驟及鑒定方法參見文獻(xiàn)[9]。

圖1 蘇丹紅I結(jié)構(gòu)類似物合成反應(yīng)原理圖Fig.1 Synthesis reaction mechanism diagram of SudanⅠanalog

1.2.2 蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物與載體蛋白的連接

蘇丹紅Ⅰ1.5mg溶解于1mL四氫呋喃(THF)中，加入NHS 1.0mg和DCC 2.0mg，置室溫避光振蕩反應(yīng)24h。每隔2h取出5μL點(diǎn)樣，進(jìn)行薄板層析，層析板置長(zhǎng)波紫外燈下觀察，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控，展層液為丙酮:乙酸乙酯:水=(5:5:2，V/V)。待反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)，10000r/min離心10min去沉淀。上清液真空抽干，得到蘇丹紅Ⅰ的活性酯；將蘇丹紅Ⅰ活性酯溶解于2mL二甲基亞砜(DMSO)中，緩慢滴入KLH溶液中(15mg溶于5mL 0.13mol/L NaHCO3)。室溫振蕩反應(yīng)4h，得到蘇丹紅Ⅰ人工抗原A(同法與BSA反應(yīng)得到蘇丹紅Ⅰ人工抗原B)。反應(yīng)結(jié)束后，0.01mol/L PBS 4℃透析72h；對(duì)透析產(chǎn)物進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)其在280nm和486nm的光密度(OD)值、蘇丹紅Ⅰ和蛋白質(zhì)在這兩種波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)(K)，按公式CSudanI/CBSA=(OD280×KBSA,486－OD486×KBSA,280)/(OD486×KSudanI,280－OD280×KSudanI,486)分析測(cè)定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)其免疫原性。

1.2.3 蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體的制備

第4次免疫間隔4周后，尾靜脈注射人工抗原0.05mg/只，3d后，取脾細(xì)胞在50% PEG融合劑作用下與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP2/O雜交瘤細(xì)胞融合。經(jīng)HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)7d后，換HT(hypoxanthine-thymidine)培養(yǎng)基培養(yǎng)，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，以蘇丹紅Ⅰ人工抗原B為檢測(cè)抗原，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，篩選分泌抗蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次均為100%的陽(yáng)性后，建立細(xì)胞系并凍存。并將雜交瘤細(xì)胞接種于提前接種降植烷的BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗。最后用Sigma單克隆抗體分型試劑盒進(jìn)行分型鑒定。

1.2.4 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法的建立

棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作質(zhì)量濃度：蘇丹紅Ⅰ人工抗原B為檢測(cè)抗原，用PBS稀釋至不同的質(zhì)量濃度(0.5、1、2、4、8、16μg/mL)，4℃包被過夜，3g/100mL脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入PBST系列稀釋的抗體，取陰性血清做陰性對(duì)照，PBST做空白對(duì)照。每孔100μL，37℃ 1h后洗滌4次，加入羊抗鼠IgG：HRP酶標(biāo)二抗(100μL/孔)；37℃作用1h后，洗滌4次。聯(lián)苯二胺(OPD)顯色，2mol/L H2SO4溶液反應(yīng)，測(cè)定492nm波長(zhǎng)吸光度(A492nm)，根據(jù)吸光度選擇最佳包被抗原的質(zhì)量濃度，然后選擇吸光度為1.0～1.5左右的抗體的稀釋倍數(shù)作為工作質(zhì)量濃度。

根據(jù)確定的最佳的包被抗原和抗體工作質(zhì)量濃度建立蘇丹紅Ⅰ間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：檢測(cè)抗原4℃包被過夜，3g/100mL脫脂牛奶封閉。加入50μL溶于體積分?jǐn)?shù)為35%甲醇溶液PBS的蘇丹紅Ⅰ(0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000ng/mL)和抗體50μL，混勻。37℃ 1h后，PBST洗滌4次，加入酶標(biāo)二抗(100μL/孔)；37℃作用1h后，洗滌4次。TMB顯色，2mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度，每個(gè)濃度測(cè)定4次，取平均值。計(jì)算各質(zhì)量濃度的結(jié)合率，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 交叉反應(yīng)率的測(cè)定

用30%甲醇PBS溶解不同濃度的蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、和蘇丹紅Ⅳ標(biāo)品，取50μL進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，計(jì)算交叉反應(yīng)率。

1.2.6 加標(biāo)回收率測(cè)定

紅辣椒經(jīng)攪碎機(jī)攪碎成辣椒粉末，稱取辣椒粉1g(精確到0.01g)，向其中加入10mL含不同質(zhì)量濃度蘇丹紅Ⅰ的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，使蘇丹紅Ⅰ在樣品中的含量分別為4000、2000、1000、500、200、80ng/g，充分振蕩5min，4000r/min離心5min，取上清液再用蒸餾水稀釋2倍進(jìn)行ELISA測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物的鑒定

紅外光譜及1HNMR光譜圖對(duì)比分析，判斷合成了蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物1-(4-羧基苯基)偶氮-2-萘酚[9]。

2.2 基于蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物的蘇丹紅Ⅰ人工抗原的合成

人工抗原的紫外掃描圖(圖2)顯示，蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物與載體蛋白BSA、KLH偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描圖譜是蘇丹紅I結(jié)構(gòu)類似物紫外掃描圖譜與載體蛋白紫外掃描圖譜的疊加，表明偶聯(lián)反應(yīng)成功。人工抗原A、B與載體分子的物質(zhì)的量比分別為232:1、13:1。

圖2 蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)類似物、人工抗原和BSA的紫外掃描圖Fig.2 UV spectra of SudanⅠanalog, artificial antigen and BSA

人工抗原免疫原性鑒定結(jié)果表明：以蘇丹紅Ⅰ人工抗原B為檢測(cè)抗原，間接ELISA測(cè)定免疫蘇丹紅Ⅰ人工抗原A后的小鼠血清抗體效價(jià)為1:32000，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，蘇丹紅Ⅰ人工抗原有效刺激機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)蘇丹紅Ⅰ的特異性免疫反應(yīng)，抗體結(jié)合率與蘇丹紅Ⅰ濃度呈線性關(guān)系， 因此，該人工抗原可用于制備抗蘇丹紅Ⅰ的單克隆抗體。

2.3 單克隆抗體的制備

圖3 蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體亞型測(cè)定結(jié)果Fig.3 Subtypes of SudanⅠmonoclonal antibody

經(jīng)細(xì)胞融合，篩選到一株分泌抗蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(6B10)，經(jīng)3次亞克隆后，全部克隆為陽(yáng)克隆。將上述細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)及凍存后復(fù)蘇，其分泌的抗體效價(jià)穩(wěn)定不變。單克隆抗體經(jīng)測(cè)定屬IgG2a型，結(jié)果見圖3。

2.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件為：包被抗原質(zhì)量濃度為2μg/mL，抗體工作濃度為1:32000，酶標(biāo)二抗工作濃度為1:1000。根據(jù)20份空白樣品測(cè)定均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)下限為0.1ng/mL，線性范圍0.5～50ng/mL，50%抑制濃度(IC50)為 6ng/mL(圖 4)。

圖4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of indirect competitive ELISA

2.5 交叉反應(yīng)率的測(cè)定

表1 單克隆抗體的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross reactivity of monoclonal antibody against SudanⅠ

由表1可見，篩選出的抗蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體與蘇丹紅Ⅰ的交叉反應(yīng)率為100%，與蘇丹紅Ⅲ的交叉反應(yīng)率為97%，可用于同時(shí)檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅲ。

2.6 加標(biāo)回收率檢測(cè)結(jié)果

將添加有不同量蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品的辣椒粉樣品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇溶液提取，用建立的競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA方法檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ含量，測(cè)得辣椒粉樣品中蘇丹紅Ⅰ的回收率為52.3%～110%，變異系數(shù)為3.2%～8.9%，結(jié)果見表2。

表2 蘇丹紅Ⅰ加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rate of SudanⅠin spiked samples

3 討論與結(jié)論

由于蘇丹紅的分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只有反應(yīng)原性而無免疫原性，必須將其與大分子載體偶聯(lián)后制成人工抗原才能激發(fā)有效的免疫反應(yīng)。選擇與載體分子偶聯(lián)的化學(xué)基團(tuán)至關(guān)重要，由于免疫細(xì)胞對(duì)載體遠(yuǎn)端的結(jié)構(gòu)識(shí)別最強(qiáng)，對(duì)與載體連接的部位的反應(yīng)不敏感，因此，選擇的偶聯(lián)基團(tuán)應(yīng)盡量遠(yuǎn)離半抗原的特征部分如苯環(huán)、雜環(huán)、氨基、羥基、羧基和雜原子等，這樣有利于制備高選擇性、高親和力的抗體[10-11]。由于蘇丹紅Ⅰ分子上只具備一個(gè)可供直接與載體偶聯(lián)的羥基基團(tuán)，常規(guī)的人工抗原制備方法和免疫程序很難誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)蘇丹紅的免疫反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，采用化學(xué)方法合成蘇丹紅Ⅰ的結(jié)構(gòu)類似物1-(4-羧基苯基)偶氮-2-萘酚，并在此基礎(chǔ)上制備人工抗原，經(jīng)免疫BALB/c小鼠后，刺激機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)蘇丹紅Ⅰ的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，成功篩選到抗蘇丹紅Ⅰ的單克隆抗體，該抗體具有較高的靈敏度和特異性，旨在為進(jìn)一步建立蘇丹紅Ⅰ免疫學(xué)檢測(cè)方法并研制快速檢測(cè)試劑盒研究提供理論基礎(chǔ)。

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Monoclonal Antibodies against Sudan I:Preparation of and Application in Indirect Competitive ELISA Detection

QIU Xue-mei，LIU Ren-rong*，XU Ling，MENG Wei，TU Shun，XIE Shao-xia
(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

Q813.2 ；TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0258-04

2010-04-26

江西省科技廳科技項(xiàng)目(GJJ10595)；江西科技師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目

裘雪梅(1981—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：qiuxuemei2165@126.com

*通信作者：劉仁榮(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：lilirenrong@hotmail.com