李從軍，謝愛娣

(1.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430068)

離子交換樹脂分離谷胱甘肽洗脫液的脫鹽研究

李從軍1，謝愛娣2

(1.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430068)

為提高離子交換樹脂法分離純化谷胱甘肽的產(chǎn)品質(zhì)量，采用大孔吸附樹脂SP-207對732強酸性離子交換樹脂分離酵母提取液中谷胱甘肽的洗脫液進(jìn)行脫鹽效果研究。在優(yōu)化的條件下，脫鹽率達(dá)到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，說明大孔樹脂SP-207用于脫鹽效果非常理想。

谷胱甘肽；脫鹽；大孔吸附樹脂

Abstract：To improve the quality of glutathione purified with 732 type ion-exchange resin column, SP-207 type macroporous adsorption resin was used to desalinate the pooled glutathione-containing eluate. Under optimized conditions, the desalinization ratio was 99.86% and the recovery rate of glutathione was 65.71%. SP-207 type macroporous resin adsorption is a good choice for desalination.

Key words：glutathione；desalination；macroporous adsorption resin

還原型谷胱甘肽(GSH)是一種廣泛存在于動、植物和微生物細(xì)胞中的具有重要生理功能的活性三肽[1]。谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)唯一的含巰基的三肽在細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用[2]，在食品工業(yè)、醫(yī)藥臨床和運動營養(yǎng)學(xué)得到廣泛的應(yīng)用。目前谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有萃取法、發(fā)酵法、酶法和化學(xué)合成法[3]。由于微生物發(fā)酵法與其他方法相比具有明顯的優(yōu)越性，是今后生產(chǎn)谷胱甘肽的主要趨勢，也是目前為止最具潛力的方法。目前報道的分離純化谷胱甘肽的方法主要有銅鹽法、樹脂法、電滲析法和雙水相法4種[4-7]。樹脂法相對其他方法經(jīng)濟(jì)效益較高，也是國外廣泛采用的方法。其中，離子交換樹脂法已有多篇專利和文獻(xiàn)報道[5,8-11]。但是，由于酵母提取液本身含有一些鹽分，且離子交換樹脂分離谷胱甘肽一般采取增強離子強度洗脫，洗脫液中也將會含有大量的鹽，為后續(xù)處理帶來麻煩、影響產(chǎn)品質(zhì)量，所以必須進(jìn)行脫鹽處理。大孔吸附樹脂是一類不同于離子交換樹脂的吸附和篩選性能相結(jié)合的分離材料，它是分離有機(jī)化合物尤其是水溶性化合物的有效手段。對有機(jī)物的選擇性良好，無機(jī)鹽的存在非但不干擾吸附反而有利于吸附[12]。本實驗采用大孔吸附樹脂對離子交換洗脫液進(jìn)行脫鹽，研究其脫鹽條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母 由本實驗室保藏。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：葡萄糖50g/L、酵母粉5g/L、KH2PO42g/L、MgSO41g/L、pH值自然。121℃滅菌30min，培養(yǎng)溫度25～28℃，搖床轉(zhuǎn)速150～180r/min。

732強酸性陽離子交換樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；大孔吸附樹脂SP-207 日本三菱化學(xué)公司。

GSH標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) Sigma公司；硝酸銀、鉻酸鉀、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(簡稱DTNB)、亞硝基鐵氰化鈉、Tris、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉(均為國產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

BSZ-100自動部分收集器、HL-2恒流泵、層析柱(φ2.6cm×20cm) 上海滬西分析儀器廠；UNICO UV-2100紫外-可見分光光度計 上海尤尼卡公司；恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠；控溫?fù)u床 中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；微量移液槍 美國熱電公司；Anke TGL-16G高速冷凍離心機(jī) 上海飛鴿公司；Mettler AE100分析天平 Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 測定方法

谷胱甘肽：采用DTNB法測定[13]；鹽濃度測定方法：以Cl－濃度表示，采用莫爾法測定[14]；洗脫終點判斷：采用亞硝基鐵氰化鈉檢測法[15]，觀察其顏色變化，若顏色變?yōu)榧t色，表明洗脫液中有還原型谷胱甘肽存在，否則，表明洗脫液中無還原型谷胱甘肽存在。

1.3.2 樹脂預(yù)處理方法

732強酸性陽離子交換樹脂：取一定量的樹脂，用自來水反洗除去機(jī)械雜質(zhì)(約3～5次)，用一定濃度的NaOH溶液洗出雜質(zhì)(約泡2h)，用去離子水洗至中性，再用一定濃度的HC1溶液轉(zhuǎn)型(約浸泡2h)，再用去離子水洗至中性，抽濾，置于具塞試劑瓶中，待用。

大孔吸附樹脂SP-207：通過乙醇(或甲醇)與水交替反復(fù)洗脫，可除去樹脂中的殘留物，一般洗脫劑用量為樹脂體積的2～3倍，交替洗脫2～3次，最終以水洗脫，保持分離使用前的狀態(tài)。使用甲醇、丙酮、或酸堿、水的反復(fù)再生處理，即可恢復(fù)樹脂的吸附能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換洗脫液制備

2.1.1 含谷胱甘肽酵母提取液制備

由斜面挑取一環(huán)菌種接種于裝液量30mL的錐形瓶，28℃、200r/min培養(yǎng)2d后接種于裝液量500mL錐形瓶，相同條件培養(yǎng)4d后收獲菌體。采用熱水抽提法[16]進(jìn)行提取，得含谷胱甘肽的酵母提取液。

2.1.2 離子交換分離谷胱甘肽洗脫液的制備

80g樹脂裝入φ2.6cm×20cm層析柱，800mL酵母提取液(谷胱甘肽含量342.21mg/L)用鹽酸調(diào)pH3.0左右，以0.5柱床體積/小時(BV/h)上柱吸附再以1BV水洗柱然后用1.0mol/L鹽酸1.0BV/h洗脫，至采用亞硝基鐵氰化鈉檢測法顏色變?yōu)闊o色，洗脫達(dá)到終點。洗脫液用氫氧化鈉中和至pH2.0～3.0。

2.2 大孔吸附樹脂SP-207脫鹽研究

2.2.1 鹽(NaCl)存在對谷胱甘肽吸附的影響

取樹脂各2g，分別加入pH2.0的400mg/L谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL，向其中加入不同質(zhì)量的NaCl固體，吸附3h后，測定上清液中谷胱甘肽含量和Cl－含量，分別計算GSH和NaCl吸附量。對表1數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，經(jīng)t檢驗，不同NaCl質(zhì)量濃度下所測結(jié)果差異不顯著(P＞0.05，n=5)，說明谷胱甘肽樣品中不同質(zhì)量濃度鹽(NaCl)的存在不影響大孔吸附樹脂對谷胱甘肽的吸附，大孔吸附樹脂對鹽基本沒有吸附作用，故可以考慮用大孔樹脂脫除離子交換樹脂洗脫液中的鹽。

表1 NaCl溶液質(zhì)量濃度對SP-207吸附谷胱甘肽的影響Table 1 Effect of NaCl concentration on glutathione adsorption on SP-207 type macroporous adsorption resin

2.2.2 鹽存在下的動態(tài)吸附曲線

80g樹脂裝入φ2.6cm×20cm層析柱，600mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液(谷胱甘肽含量400mg/L，NaCl溶液濃度1.5mol/L，pH2.0)以0.5BV上柱吸附然后用自動部分收集器收集(10mL/管)，吸附曲線如圖1所示。

圖1 NaCl存在下谷胱甘肽動態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of glutathione in the presence of NaCl

由圖1可知，NaCl幾乎在樹脂上不吸附就直接流出、濃度很快就達(dá)到最大。所以，可以考慮上柱吸附后，先用水洗出鹽，再用甲醇溶液洗脫谷胱甘肽。

2.2.3 離子交換洗脫液上柱脫鹽實驗

圖2 SP-207脫鹽曲線Fig.2 Desalination curve of SP-207 type macroporous adsorption resin

80g樹脂裝入φ2.6cm×20cm層析柱，取50mL離子交換樹脂洗脫濃縮液(谷胱甘肽含量960mg/L，在樹脂最大吸附范圍內(nèi)，無泄漏)調(diào)節(jié)pH2.0以0.5BV上柱吸附，然后用1BV pH2.0去離子水洗脫除鹽，再用70%甲醇洗脫谷胱甘肽，然后用自動部分收集器收集6mL/管后測定各管谷胱甘肽和Cl－含量，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，鹽峰和谷胱甘肽峰能完全分開，中間采用1BV水進(jìn)行洗脫鹽已經(jīng)足夠?qū)Ⅺ}脫除，水用量太少則兩峰間會出現(xiàn)交叉、用量太大將延長操作時間不利于谷胱甘肽的穩(wěn)定，故最終選擇1BV水洗脫除鹽。在此條件下，脫鹽率達(dá)到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，說明大孔樹脂用于脫鹽效果非常理想。

3 結(jié) 論

采用大孔吸附樹脂對谷胱甘肽的離子交換樹脂分離洗脫液進(jìn)行了脫鹽研究，脫鹽率達(dá)到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，說明大孔樹脂是一種非常有效的脫鹽方法。而且，大孔吸附樹脂在脫鹽的同時也能對谷胱甘肽起到一定的分離純化作用。

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Macroporous Resin Adsorption for the Desalination of Glutathione-containing Eluate from Ion-exchange Resin Column

LI Cong-jun1，XIE Ai-di2
(1. Hubei Vocational College of Bio-technology, Wuhan 430070, China；2. College of Engineering and Technology, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Q819

A

1002-6630(2010)18-0067-03

2010-06-17

李從軍(1979—)，男，助教，碩士，研究方向為生物分離純化技術(shù)。E-mail：licongjun1979@163.com