王 艷，汪海波*，桂 萌，王孟津，張含俊，劉良忠

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

草魚(yú)魚(yú)鱗中活性膠原蛋白提取工藝及參數(shù)優(yōu)化

王 艷，汪海波*，桂 萌，王孟津，張含俊，劉良忠

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料，在低于蛋白變性溫度的條件下提取酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)，并對(duì)魚(yú)鱗原料的前處理方法、膠原蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在魚(yú)鱗原料的前處理工藝中，以0.1mol/L的Na2CO3溶液為試劑脫除原料中雜蛋白的最佳工藝條件為室溫、料液比1:40(g/mL)，300r/min攪拌處理3次，每次6h；以0.3mol/L的EDTA為試劑脫除原料中礦物質(zhì)雜質(zhì)的最佳工藝條件為室溫、料液比1:60，攪拌處理3次，每次12h；ASC的最佳提取工藝條件為：提取溫度不高于25℃，料液比1:60，醋酸濃度0.8mol/L，提取3次，每次24h；PSC的最佳提取工藝條件為：胃蛋白酶用量為魚(yú)鱗原料質(zhì)量的3.0%、醋酸濃度0.8mol/L、料液比1:30、提取溫度4℃、提取2次，每次24h。

草魚(yú)魚(yú)鱗；膠原蛋白；提?。粎?shù)優(yōu)化

Abstract：Acid-soluble collagen (ASC) and pepsin-soluble collagen (PSC) were extracted from the scales of grass carp at low temperature, and optimal extraction parameters were explored. The optimal parameters for removing impurity proteins from fish scales with 0.1 mol/L Na2CO3 were material/liquid ratio of 1:40 for mixing 3 times for 6 h each time at room temperature. The optimal parameters for removing mineral impurities with 0.3 mol/L EDTA were material/liquid ratio of 1:60 for mixing 3 times 12 h for each time at room temperature. The optimal parameters for ASC extraction were material/liquid ratio of 1:60 for extraction with 0.8 mol/L acetic acid 3 times for 24 h each time at 25 ℃. The optimal parameters for PSC extraction were amount of pepsin on the basis of the weight of fish scales, 3.0%; acetic acid concentration, 0.8 mol/L; and material/liquid ratio 1:30 for twice extraction at 4 ℃ for 24 h each time.

Key words：the scales of grass carp；collagen；extraction；optimal parameters

中國(guó)是世界上水產(chǎn)品產(chǎn)量最大的國(guó)家，淡水魚(yú)產(chǎn)量約占全國(guó)水產(chǎn)總量的60%左右。近年來(lái)，我國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展的同時(shí)也帶動(dòng)了水產(chǎn)加工業(yè)規(guī)模的不斷提高，這也就意味著養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的低值淡水魚(yú)加工品的比例將越來(lái)越大，其加工下腳料如魚(yú)鱗、魚(yú)皮和魚(yú)骨等也將逐年增長(zhǎng)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)這些下腳料沒(méi)有充分利用，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)并污染環(huán)境。研究表明，淡水魚(yú)魚(yú)鱗、魚(yú)皮中含有豐富的膠原蛋白，通過(guò)提取利用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，這些膠原蛋白資源，特別是保持完整三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原蛋白在化妝品、生物醫(yī)學(xué)材料以及食品添加劑等領(lǐng)域均具有潛在的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值[1-9]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)淡水魚(yú)中膠原資源的開(kāi)發(fā)尚處于起步階段，相關(guān)研究主要集中在膠原產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)鑒定和性能表征等方面。如張艷等[10]從草魚(yú)皮中提取膠原蛋白并分析了其氨基酸組成、變性溫度和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；鐘朝輝等[11-12]系統(tǒng)研究了草魚(yú)魚(yú)鱗中酶溶性膠原蛋白的黏度特性和分子的溶液行為；王孟津等[13]和王海波等[14]曾對(duì)草魚(yú)魚(yú)鱗中膠原蛋白的基本理化性能、生物力學(xué)性能等進(jìn)行了相關(guān)研究。膠原蛋白的性能與膠原類(lèi)型、來(lái)源以及提取方法等因素有密切關(guān)聯(lián)，其中，膠原蛋白的提取方法對(duì)如何獲取高活性、高產(chǎn)率的膠原產(chǎn)品具有至關(guān)重要的影響。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)淡水魚(yú)中膠原蛋白提取工藝和提取方法的研究較少且缺乏系統(tǒng)性，這在一定程度上阻礙了淡水魚(yú)膠原資源的開(kāi)發(fā)進(jìn)程。為此，本研究以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料，在低于膠原變性溫度的條件下提取、制備活性膠原蛋白產(chǎn)品，系統(tǒng)研究膠原蛋白提取過(guò)程中，原料的預(yù)處理方法和酸溶性膠原蛋白(ASC)、酶溶性膠原蛋白(PSC)的最佳提取工藝條件與工藝參數(shù)，為淡水魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供可以借鑒的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售新鮮草魚(yú)，取魚(yú)鱗，用清水仔細(xì)洗滌干凈后冷凍保藏備用。

胃蛋白酶(3000U/g) 武漢市華順生物技術(shù)有限公司；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；無(wú)水Na2CO3、NaCl、NaOH、EDTA等(均為國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary-50型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌機(jī) 江省金壇市醫(yī)療儀器廠；TDL-50型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ZFQ85-A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Lg105-2型真空冷凍干燥機(jī) 北京醫(yī)用實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)鱗膠原蛋白的制備工藝路線

工藝流程：魚(yú)鱗→清水漂洗、瀝干→低溫鼓風(fēng)干燥→粉碎→浸泡脫除雜蛋白→清水漂洗、瀝干→浸泡脫除礦物雜質(zhì)→清水漂洗、瀝干→提取酸溶性膠原蛋白(ASC)→殘?jiān)崛∶溉苄阅z原蛋白(PSC)

操作要點(diǎn)：魚(yú)鱗洗滌瀝干后用一定料液比(g/mL)的溶劑浸泡脫除可溶性雜蛋白，分離上清液后，殘?jiān)^續(xù)用一定料液比的EDTA溶液脫除原料中的礦物質(zhì)雜質(zhì)，脫雜后的魚(yú)鱗依次用醋酸和醋酸+胃蛋白酶提取酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)。前期研究[13]表明，草魚(yú)魚(yú)鱗酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的變性起始溫度分別為30℃和28℃，因此本次實(shí)驗(yàn)中，在無(wú)特殊說(shuō)明的情況下，所有提取操作過(guò)程均在低于25℃的條件下完成。

1.3.2 羥脯氨酸的定量測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定膠原蛋白特征氨基酸——羥脯氨酸含量的方法，間接評(píng)價(jià)膠原蛋白的提取效果。參考文獻(xiàn)[15]方法，以羥脯氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以對(duì)二甲基氨基苯甲醛為顯色劑，比色法定量測(cè)定羥脯氨酸含量，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0636X+0.0896，式中：X為羥脯氨酸質(zhì)量濃度/(mg/L)；y為561nm處吸光度(A)，R2=0.9991。

1.3.3 魚(yú)鱗原料及提取液中羥脯氨酸總含量的測(cè)定

精確稱取1g魚(yú)鱗粉，加入50mL濃度為6mol/L的鹽酸，在105℃鼓風(fēng)干燥箱中密封水解24h，用蒸餾水定容至100mL。準(zhǔn)確移取1mL該水解液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0后蒸餾水定容至100mL，按1.3.2節(jié)方法測(cè)定羥脯氨酸含量，計(jì)算出魚(yú)鱗中羥脯氨酸總含量為77.5mg/g魚(yú)鱗原料(干基)。吸取10mL膠原蛋白提取液，按上述方法測(cè)定提取液中羥脯氨酸的含量，計(jì)算羥脯氨酸的提取率。

1.3.4 脫雜上清液中鈣離子和雜蛋白的定量測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB/T 15452—95《工業(yè)循環(huán)冷卻水中鈣、鎂離子的測(cè)定》中方法測(cè)定脫雜上清液中鈣離子總含量，通過(guò)測(cè)定一定體積脫雜上清液在280nm處吸光度的方法評(píng)價(jià)溶液體系中蛋白含量。

1.3.5 草魚(yú)魚(yú)鱗中雜蛋白的脫除及參數(shù)優(yōu)化

分別采用NaOH、NaCl、Na2CO3溶液作為雜蛋白的脫除試劑，進(jìn)行脫雜蛋白處理。精確稱取1g魚(yú)鱗粉，精確加入50mL的脫雜試劑，浸泡10h后吸取脫雜上清液，分別測(cè)定其在280nm處的吸光度和溶液中羥脯氨酸含量，綜合比較幾種試劑脫除雜蛋白的效果和膠原蛋白的流失情況(用羥脯氨酸的溶出率為評(píng)價(jià)指標(biāo))。以Na2CO3溶液作為雜蛋白的脫除試劑，分別改變Na2CO3濃度、處理溫度、時(shí)間、料液比、處理次數(shù)等條件因素，考察各因素對(duì)雜蛋白脫除效果的影響。

1.3.6 草魚(yú)魚(yú)鱗中礦物質(zhì)雜質(zhì)的脫除及參數(shù)優(yōu)化

選擇EDTA溶液作為魚(yú)鱗中礦物質(zhì)雜質(zhì)的脫除試劑，以脫雜上清液中鈣離子總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察EDTA溶液濃度、脫雜溫度、料液比等因素對(duì)礦物質(zhì)雜質(zhì)脫除效果的影響。

1.3.7 草魚(yú)魚(yú)鱗中酸溶性膠原蛋白的提取工藝研究

經(jīng)過(guò)脫除雜蛋白和礦物質(zhì)雜質(zhì)處理后的魚(yú)鱗經(jīng)過(guò)充分洗滌和低溫干燥，作為膠原蛋白提取原料。以醋酸溶液為提取溶劑，分別改變醋酸濃度、提取溫度、時(shí)間、提取次數(shù)等因素，考察不同條件因素對(duì)ASC提取效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、醋酸濃度和提取時(shí)間做三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.8 草魚(yú)魚(yú)鱗中酶溶性膠原蛋白的提取工藝研究

提取酸溶性膠原蛋白后的魚(yú)鱗殘?jiān)?jīng)過(guò)充分洗滌和低溫干燥后，作為膠原蛋白提取原料。以胃蛋白酶作為水解酶，以醋酸為提取溶劑，分別考察酶用量、提取料液比、提取時(shí)間等因素對(duì)PSC提取效果的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇加酶量、醋酸濃度和提取溫度做三因素三水平正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)鱗原料中雜蛋白脫除工藝與參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 雜蛋白脫除試劑的選擇

除膠原蛋白外，魚(yú)鱗中還含有部分其他種類(lèi)的雜蛋白成分，必須在提取膠原蛋白之前予以去除，這樣可以有效降低后續(xù)純化的難度并提高膠原產(chǎn)品的純度。本實(shí)驗(yàn)分別以0.5mol/L的Na2CO3、NaCl和NaOH溶液作為雜蛋白脫除試劑，以脫雜上清液中羥脯氨酸溶出率和280nm處吸光度作為脫雜效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較不同試劑的雜蛋白脫除效果和膠原蛋白流失情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同試劑對(duì)雜蛋白脫除效果的比較Fig.1 Comparison of the removal of protein impurities using different solvents

由圖1可得，在相同濃度下，NaOH溶液對(duì)蛋白質(zhì)有極高的溶出率，但在溶出雜蛋白的同時(shí)，魚(yú)鱗原料中膠原蛋白(羥脯氨酸)的流失率也遠(yuǎn)高于其他兩種脫雜試劑；與NaCl溶液和NaOH溶液相比，Na2CO3溶液脫雜上清液中膠原蛋白的流失率遠(yuǎn)低于NaOH溶液，而其對(duì)雜蛋白的脫除效果明顯優(yōu)于NaCl溶液，因此最終優(yōu)選Na2CO3溶液作為雜蛋白的脫除試劑。

2.1.2 雜蛋白脫除工藝參數(shù)的優(yōu)化

選擇Na2CO3溶液作為雜蛋白的脫除試劑，以脫雜上清液在280nm處吸光度為測(cè)定指標(biāo)，分別改變Na2CO3溶液濃度、操作溫度、時(shí)間等條件，考察各因素對(duì)雜蛋白脫除效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可得，Na2CO3濃度在0.1～0.9mol/L、脫雜料液比在1:40～1:100范圍內(nèi)改變時(shí)，雜蛋白脫除效果變化不大；溫度和攪拌操作對(duì)雜蛋白脫除效果有比較明顯的影響，高速攪拌和提高體系溫度可有效增強(qiáng)雜蛋白的溶出率，但考慮到淡水魚(yú)膠原蛋白的體外變性溫度一般均低于30℃，因此仍選擇25℃作為雜蛋白的脫除溫度；雜蛋白脫除操作重復(fù)3次，每次脫雜處理6h后，脫雜上清液中蛋白質(zhì)溶出率不再增加。因此，魚(yú)鱗原料中雜蛋白脫除的優(yōu)選工藝參數(shù)為：以0.1mol/L的Na2CO3溶液為脫雜試劑，料液比1:40，室溫，300r/min攪拌脫雜3次，每次6 h。

圖2 不同因素對(duì)雜蛋白脫除效果的影響Fig.2 Effects of different factors on the removal of protein impurities

2.2 魚(yú)鱗原料中礦物質(zhì)雜質(zhì)脫除工藝參數(shù)優(yōu)化

圖3 不同因素對(duì)礦物質(zhì)雜質(zhì)脫除效果的影響Fig.3 Effect of different factors on the removal of mineral impurities

以羥基磷灰石為主要存在形式的礦物質(zhì)是魚(yú)鱗中的主要組成成分之一，魚(yú)鱗中的膠原蛋白往往與礦物質(zhì)成分緊密的結(jié)合在一起，增加了膠原的提取難度。研究表明[7]，酸溶液和EDTA溶液對(duì)魚(yú)鱗中的礦物質(zhì)雜質(zhì)均具有理想的脫除效果，但是酸溶液在脫除礦物質(zhì)雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致原料中酸溶性膠原蛋白的流失，因此本研究選擇EDTA作為魚(yú)鱗原料中礦物質(zhì)雜質(zhì)的脫除試劑。以脫雜上清液中鈣離子含量作為脫雜效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，分別考察EDTA濃度、脫雜溫度、料液比以及脫雜時(shí)間和脫雜次數(shù)等因素對(duì)魚(yú)鱗中礦物質(zhì)雜質(zhì)脫除效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可得，EDTA濃度為0.3mol/L、料液比為1:60、浸泡脫雜時(shí)間12h的條件下脫雜效果最好；25℃時(shí)最有利于礦物質(zhì)雜質(zhì)的脫除；脫雜操作重復(fù)3次后，EDTA脫雜液對(duì)礦物質(zhì)雜質(zhì)的溶出率不再增加。

2.3 草魚(yú)魚(yú)鱗中酸溶性膠原蛋白(ASC)的提取工藝

草魚(yú)魚(yú)鱗原料經(jīng)脫除雜蛋白和礦物質(zhì)雜質(zhì)后，以醋酸為提取溶劑，提取酸溶性膠原蛋白(ASC)，以膠原蛋白特征氨基酸——羥脯氨酸的提取率作為膠原蛋白提取效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，別通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究了不同提取條件因素對(duì)ASC提取效果的影響并確定了ASC的最佳提取工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和表1所示。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提高提取溫度和醋酸濃度有利于ASC的提取，但考慮到淡水魚(yú)膠原蛋白的變性溫度一般低于30℃以及高酸度條件下可能導(dǎo)致膠原分子結(jié)構(gòu)的改變，因此仍選擇在較低的酸度和低于室溫的條件下提取較為適宜；增加提取次數(shù)、提高提取料液比和延長(zhǎng)提取時(shí)間均可提高ASC的提取率，但當(dāng)單次提取時(shí)間超過(guò)24h、提取次數(shù)超過(guò)3次后，ASC的提取率不再增加。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在單次提取過(guò)程中，醋酸濃度、提取料液比和提取時(shí)間3因素對(duì)ASC提取效果的影響依次減弱。結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，以醋酸為溶劑提取ASC的最佳提取工藝條件是：提取溫度不高于25℃，料液比1:60，醋酸濃度0.8mol/L，提取3次，每次提取時(shí)間24h。

圖4 ASC提取單因素試驗(yàn)Fig.4 Effects of different factors on ASC extraction

表1 ASC提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Arrangement of the orthogonal array design for optimizing ASC extraction and experimental results

2.4 草魚(yú)魚(yú)鱗中酶溶性膠原蛋白(PSC)的提取工藝研究

圖5 PSC提取單因素試驗(yàn)Fig.5 Effects of different factors on PSC extraction

以提取ASC后的魚(yú)鱗殘?jiān)鼮樵希捎梦傅鞍酌杆饨Y(jié)合醋酸提取的方法進(jìn)一步提取酶溶性膠原蛋白(PSC)，以膠原蛋白特征氨基酸——羥脯氨酸的提取率作為膠原蛋白提取效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，分別通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究不同提取因素對(duì)PSC提取效果的影響并確定了PSC的最佳提取工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和表2所示。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在胃蛋白酶添加量為魚(yú)鱗原料質(zhì)量的2.5%、醋酸濃度為1.0mol/L、提取時(shí)間24h的條件下，PSC的提取率達(dá)到最大，在低于膠原蛋白變性溫度時(shí)，提高酶水解提取溫度會(huì)降低PSC提取率，在高于膠原蛋白變性溫度時(shí)，PSC提取率隨溫度的升高而增加；2次提取可有效提高PSC的提取效率，但進(jìn)一步增加提取次數(shù)后，PSC的總提取率增加不明顯；增大提取料液比對(duì)提取效果的影響不大。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在所選擇的3個(gè)影響因素中，酶添加量、醋酸濃度和提取溫度對(duì)PSC提取效果的影響依次減弱。結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，PSC的提取最佳工藝條件為胃蛋白酶用量為魚(yú)鱗原料質(zhì)量的3.0%、醋酸濃度0.8mol/L、提取料液比1:30、提取溫度4℃、提取2次，每次提取時(shí)間24h。

表2 PSC提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement of the orthogonal array design for optimizing PSC extraction and experimental results

3 結(jié) 論

以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料，分別采用Na2CO3溶液脫雜蛋白、EDTA溶液脫礦物質(zhì)雜質(zhì)的方法進(jìn)行原料的前處理以提高魚(yú)鱗膠原蛋白的提取效率和產(chǎn)品純度；經(jīng)過(guò)前處理的魚(yú)鱗原料依次用酸溶液和胃蛋白酶與酸溶液提取酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了魚(yú)鱗前處理的方法、工藝條件以及酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的最佳工藝條件，結(jié)果表明：魚(yú)鱗原料中雜蛋白脫除的優(yōu)選工藝參數(shù)為以0.1mol/L的Na2CO3溶液為脫雜試劑、料液比1:40、室溫、300r/min攪拌脫雜3次、每次6h；魚(yú)鱗原料中礦物質(zhì)雜質(zhì)脫除的適宜藝條件為以0.3mol/L的EDTA溶液為脫雜試劑、在25℃條件下脫雜、料液比為1:60、攪拌提取3次、每次12h；ASC的適宜取工藝條件為提取溫度不高于 25℃、料液比1:60、醋酸濃度0.8mol/L、提取3次、每次提取時(shí)間24h；PSC的適宜提取工藝條件為胃蛋白酶用量為魚(yú)鱗原料質(zhì)量的3.0%、醋酸濃度0.8mol/L、提取料液比1:30、提取溫度4℃、提取2次，每次提取時(shí)間24h。

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Extraction Optimization of Collagen from Grass Carp Scales

WANG Yan，WANG Hai-bo*，GUI Meng，WANG Meng-jin，ZHANG Han-jun，LIU Liang-zhong
(School of Food Science and Technology, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

TS201.7

A

1002-6630(2010)18-0070-07

2010-06-21

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2009CDA117)；武漢市科技局科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(200920137006)；武漢工業(yè)學(xué)院研究生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃資助項(xiàng)目(ZD16)

王艷(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：wy2008@163.com

*通信作者：汪海波(1971—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：wanghaibo@whpu.edu.cn