謝偉全，張貴鋒，高玲，劉永東，余蓉，蘇志國

1 四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都 610041 2 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

層析輔助體外復(fù)性含有多對二硫鍵的融合蛋白質(zhì)

謝偉全1,2，張貴鋒2，高玲1，劉永東2，余蓉1，蘇志國2

1 四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都 610041 2 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

為建立一種基于陰離子交換介質(zhì)輔助的含多對二硫鍵的抗凝溶栓雙功能水蛭素 12肽-瑞替普酶融合蛋白質(zhì)(HV12p-rPA)的復(fù)性方法，采用Q Sepharose XL作為層析復(fù)性介質(zhì)，通過正交實(shí)驗(yàn)考察蛋白質(zhì)上樣量、流速、脲梯度、洗脫液中精氨酸濃度、脲濃度、pH、還原型及氧化型谷胱甘肽等因素對復(fù)性過程的影響，探索最佳層析復(fù)性條件。結(jié)果表明：脲梯度、上樣量及精氨酸濃度是影響復(fù)性的 3個(gè)主要因素。脲梯度是復(fù)性成功的關(guān)鍵，上樣量增大時(shí)復(fù)性蛋白質(zhì)比活降低，精氨酸輔助 HV12p-rPA復(fù)性的最佳濃度為 1 mol/L。創(chuàng)建了脲、pH雙梯度下的陰離子交換層析輔助HV12p-rPA的復(fù)性方法，復(fù)性后蛋白質(zhì)的溶栓比活達(dá)到46 520 IU/mg，抗凝比活達(dá)到9 980 ATU/mg，與稀釋復(fù)性方法相比，該方法能使復(fù)性蛋白質(zhì)的溶栓比活提高14～15倍，抗凝比活提高7～8倍。

融合蛋白質(zhì)，陰離子交換層析，復(fù)性，二硫鍵

Abstract:To establish a refolding process for the protein fused with 12-peptide of hirudin and reteplase(HV12p-rPA), we developed an anion-exchange chromatography assisted method to form correct disulfide bonds.After evaluating various parameters by orthogonal experiments with Q Sepharose XL as refolding medium, we found that urea gradient, sample loading size and L-Arg concentration were three major factors to affect the refolding outcomes, and urea gradient was critical to the recovery yield.Meanwhile, enzymatic activity of the refolded protein was decreased by the increase of sample loading size, and the optimal concentration of L-Arg in the eluting buffer was 1 mol/L.Thus, a dual-gradient of urea and pH on the anion-exchange chromatography resulted in remarkable increase of specific fibrinolytic and anti-coagulative activities of the refolded protein.Compared with the dilution method for refolding HV12p-rPA, the present approach was more effective and advantageous.

Keywords:fusion protein, anion exchange chromatography, refolding, disulfide bond

瑞替普酶(Reteplase，r-PA)是人組織纖溶酶原激活劑(t-PA)的重組異構(gòu)體，可使血栓中的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，后者使不溶性成網(wǎng)狀的纖維蛋白單體轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘睦w維蛋白降解產(chǎn)物，從而達(dá)到溶解血栓的效果。水蛭素(Hirudin)為凝血酶的特異性抑制劑，其C末端的12肽(53～64 aa)是其具有最大抗凝活性所必需的最小肽段，能與纖維蛋白原競爭結(jié)合凝血酶并阻止凝血酶降解纖維蛋白原。本研究室在前期工作中借助生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，對水蛭素 12肽-瑞普替酶融合蛋白質(zhì)(HV12p-rPA)進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬及功能預(yù)測，并構(gòu)建表達(dá)了重組HV12p-rPA融合基因。經(jīng)基因測序、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析、體外生物學(xué)活性檢測以及動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)研究，證實(shí)所得HV12p-rPA結(jié)構(gòu)正確且具有抗凝血和溶栓雙重功能，表明該融合蛋白質(zhì)可作為一種潛在的兼具抗凝和溶栓效果的新藥[1-3]。由于HV12p-rPA是一種含有 9對二硫鍵的非天然蛋白質(zhì)，利用傳統(tǒng)的稀釋、透析復(fù)性等方法恢復(fù)其抗凝和溶栓雙重活性具有較高的難度。梁蘭等[4]采用梯度透析的方法對HV12p-rPA進(jìn)了復(fù)性研究，獲得的復(fù)性蛋白質(zhì)溶栓比活只有19 678 IU/mg，抗凝比活僅有730 ATU/mg。

層析介導(dǎo)的蛋白質(zhì)體外復(fù)性技術(shù)通過引入層析介質(zhì)，可阻隔蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，從而降低聚集體的形成，同時(shí)具有可在較高蛋白質(zhì)濃度下操作，并能在蛋白質(zhì)復(fù)性的過程中濃縮目標(biāo)蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，因而引起廣泛關(guān)注。目前，非吸附型的凝膠過濾層析、吸附型的離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析等層析復(fù)性技術(shù)已成功用于核糖核酸酶A、溶菌酶以及重組人干擾素等蛋白質(zhì)的復(fù)性[5-9]。

本研究旨在探索一種采用陰離子交換層析復(fù)性HV12p-rPA的方法，系統(tǒng)考察上樣量、流速、洗脫液中精氨酸濃度、脲濃度、pH值等因素對折疊過程及復(fù)性蛋白質(zhì)活性的影響，在此基礎(chǔ)上建立一種復(fù)性同時(shí)純化HV12p-rPA的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

?KTA purifier 10、Superdex 75、紫外分光光度計(jì) Ultrospec 2100 pro、Q Sepharose XL介質(zhì)(GE Healthcare，USA)；Agilent1100 Series(Agilent，USA)；高速離心機(jī)H-2050R(長沙湘儀)，Gel Image System(Tanon 1600，China)。Tryptone、Yeast Extract(OXOID，England)；氧化型谷胱甘肽(GSSG)及還原型谷胱甘肽(GSH)(Japan)；人纖維蛋白原(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所)；尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢驗(yàn)所)；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 菌株

含有pET-21α/HV12p-rPA重組質(zhì)粒的大腸桿菌E.coliBL21由四川大學(xué)華西藥學(xué)院構(gòu)建、保存[1]。

1.3 工程菌發(fā)酵及融合蛋白包涵體的獲得

按文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.4 融合蛋白包涵體的變性方法

按照1 g包涵體 ∶ 1 0 mL 變性劑(8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，1% β-巰基乙醇，pH 8.5)的比例于40℃下變性8 h，12 000 r/min離心20 min，取上清液即得變性蛋白液。

1.5 融合蛋白變性液的脈沖稀釋復(fù)性

用緩沖液 1(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，50 mmol/L GSSG，0.5 mol/L L-Arg，pH 9.2)將變性蛋白液稀釋至5～10 mg/mL，于25℃條件下溫育6 h后用緩沖液2(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 9.2)將蛋白質(zhì)濃度稀釋至0.8 mg/mL。將稀釋后的變性蛋白液等分成3等份，分3次加入到一定量的復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L GSH，1 mmol/L EDTA，0.7 mol/L L-Arg，pH 8.5)中，每次間隔2 h，復(fù)性48 h。分別于變性蛋白液全部加入復(fù)性緩沖液后 6、12、24、36、48 h取樣測定抗凝及溶栓活性。

1.6 融合蛋白變性液的Q Sepharose XL(5 mL)層析復(fù)性

1.6.1 層析復(fù)性方法

無梯度的離子交換層析復(fù)性：使用緩沖液 A(50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L Urea，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)平衡層析柱并進(jìn)樣，待β-巰基乙醇及不結(jié)合蛋白質(zhì)穿透后，用洗脫緩沖液B(0.2 mol/L Tris-HCl，2 mol/L Urea，3 mmol/L GSH，1 mmol/LGSSG，1 mol/L L-Arg，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)直接洗脫，收集洗脫峰，透析后測定蛋白質(zhì)濃度及活性。流速為0.6 mL/min。

脲梯度的離子交換層析復(fù)性：使用緩沖液 A(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)平衡層析柱并進(jìn)樣，待β-巰基乙醇及不結(jié)合蛋白質(zhì)穿透后，在運(yùn)行一個(gè)柱體積的梯度下，逐漸換成 100%的洗脫緩沖液 B(0.2 mol/L Tris-HCl，1 mol/L Urea，3 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，1 mol/L L-Arg，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)洗脫，收集洗脫峰，透析后測定蛋白質(zhì)濃度及活性。流速為0.6 mL/min。

pH梯度的離子交換層析復(fù)性：使用緩沖液 A(50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L Urea，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)平衡層析柱并進(jìn)樣，待β-巰基乙醇及不結(jié)合蛋白質(zhì)穿透后，在運(yùn)行一個(gè)柱體積的梯度下，逐漸換成 100%的洗脫緩沖液 B(0.2 mol/L Tris-HCl，2 mol/L Urea，3 mmol/L GSH，1mmol/L GSSG，1 mol/L L-Arg，1 mmol/L EDTA，pH 10.5)洗脫，收集洗脫峰，透析后測定蛋白質(zhì)濃度及活性。流速為0.6 mL/min。

脲及pH雙梯度的離子交換層析復(fù)性：使用緩沖液 A(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)平衡層析柱并進(jìn)樣，待β-巰基乙醇及不結(jié)合蛋白質(zhì)穿透后，在運(yùn)行一個(gè)柱體積的梯度下，逐漸換成 100%的洗脫緩沖液 B(0.2 mol/L Tris-HCl，1 mol/L Urea，3 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，1 mol/L L-Arg，1 mmol/L EDTA，pH 10.5)洗脫，收集洗脫峰，透析后測定蛋白質(zhì)濃度及活性。流速為0.6 mL/min。

1.6.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交表L18(37)對上樣量(A)、流速(B)、梯度(C)、洗脫液脲濃度(D)、洗脫液精氨酸濃度(E)、洗脫液 pH(F)、洗脫液GSH/GSSG(G)等7個(gè)因素(表 1)，依上述層析復(fù)性操作方法進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對復(fù)性影響較大的上樣量、洗脫液精氨酸濃度、流速等因素進(jìn)行單因素考察。

1.7 生物活性測定方法

溶栓活性的測定采用纖維蛋白-瓊脂糖平板測定法[10]進(jìn)行測定?？鼓钚缘臏y定采用滴定法[11]進(jìn)行測定。

1.8 蛋白質(zhì)濃度的測定方法

采用Bradford法[12]進(jìn)行測定。

1.9 復(fù)性產(chǎn)物的凝膠過濾(SEC)分析

色譜柱：Superdex 75(10/300 GL)；緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl，2 mol/L Urea，0.15 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；UV：280 nm。具體操作參考文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的稀釋復(fù)性

2.1.1 稀釋復(fù)性過程

如圖1所示，脈沖稀釋復(fù)性24 h后(蛋白質(zhì)終濃度為 80.0 μg/mL)，復(fù)性液的溶栓比活達(dá)到最大為2 900 IU/mg，而抗凝比活在36 h達(dá)到最大為4 120 ATU/mg?？梢娫撊诤系鞍椎娜芩ú糠?r-PA)與抗凝部分(水蛭素12肽)的復(fù)性過程都較為緩慢但復(fù)性過程并不完全同步。

2.1.2 蛋白質(zhì)終濃度對稀釋復(fù)性的影響

如圖2所示，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，融合蛋白的溶栓及抗凝比活均急劇下降。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為40 μg/mL時(shí)，融合蛋白質(zhì)的溶栓及抗凝比活分別為8 360 IU/mg、4 550 ATU/mg，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度達(dá)到120 μg/mL時(shí)，融合蛋白的溶栓及抗凝活性幾乎為0。蛋白質(zhì)的稀釋復(fù)性過程中存在蛋白質(zhì)正確折疊和聚集兩種相互競爭的途徑。由于聚集作用是二級甚至更高一級的反應(yīng)，蛋白質(zhì)濃度的增高更有利于聚集體的形成，造成正確折疊蛋白質(zhì)的急劇減少，復(fù)性液活性迅速降低。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

圖1 融合蛋白的稀釋復(fù)性過程(蛋白質(zhì)終濃度為80.0 μg/mL，復(fù)性溫度為25℃)Fig.1 Dilution refolding process of the fusion protein.The final protein concentration is 80.0 μg/mL, refolding temperature is 25°C.

圖2 蛋白終濃度對稀釋復(fù)性過程的影響(復(fù)性溫度為25℃)Fig.2 Effect of final protein concentration on dilution refolding process of fusion protein.Refolding temperature is 25°C.

2.2 不同梯度下的Q Sepharose XL離子交換層析復(fù)性

梯度是層析復(fù)性技術(shù)中提高蛋白質(zhì)復(fù)性率的常用技術(shù)手段，設(shè)置梯度(脲、pH等)可使變性蛋白質(zhì)在一個(gè)相對緩和的環(huán)境下逐漸復(fù)性，防止環(huán)境的突然變化造成蛋白質(zhì)的“休克”，從而提高蛋白質(zhì)活性收率[14]。本研究首先分析了梯度(脲、pH等)對蛋白質(zhì)復(fù)性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梯度特別是脲梯度對復(fù)性影響顯著。如表 2所示，在沒有任何梯度或僅有 pH梯度的情況下，復(fù)性蛋白質(zhì)未檢測出溶栓活性，抗凝活性亦很低。而存在脲梯度或同時(shí)存在脲及pH梯度的情況下，兩者都大幅提高，同時(shí)層析復(fù)性具有一定的純化作用(圖3)。如圖4所示，層析復(fù)性所得洗脫峰的SDS-PAGE分析顯示雜蛋白條帶減少，目標(biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描并通過Gel-Pro Analyzer軟件分析，其純度達(dá)到90%。

表2 梯度對融合蛋白復(fù)性的影響Table 2 Influences of gradients on the refolding of the fusion protein

圖3 融合蛋白的Q Sepharose XL層析復(fù)性圖(脲及pH雙梯度)Fig.3 Chromatographic curve of IEC refolding process of HV12p-rPA(urea and pH dual gradient).

2.3 離子交換層析復(fù)性的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 融合蛋白Q Sepharose XL層析復(fù)性(脲及pH雙梯度)后的還原型SDS-PAGE分析(銀染法)Fig.4 Reduced SDS-PAGE analysis of HV12p-rPA by chromatography(urea and pH dual gradient)refolding(silver staining).1: denatured protein; 2: the passing through peak from chromatography; 3: protein marker; 4: the eluted peak from chromatography.

不同梯度條件下層析復(fù)性的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脲梯度的設(shè)置對層析復(fù)性結(jié)果影響顯著。但影響層析復(fù)性結(jié)果的因素較多。故選擇上樣量、流速、梯度、洗脫液脲濃度、洗脫液精氨酸濃度、洗脫液pH、洗脫液GSH/GSSG等7個(gè)因素進(jìn)了正交實(shí)驗(yàn)研究(表3)。通過正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析可以得出，影響復(fù)性蛋白質(zhì)溶栓及抗凝比活的2個(gè)主要因素是上樣量及洗脫液精氨酸濃度。最佳的復(fù)性條件(以溶栓活性計(jì))為A1B2C1D3E3F3G2，即上樣量為0.125 mg/mL介質(zhì)，流速為0.6 mL/min，梯度大小為0.5 mL/mL介質(zhì)，洗脫液脲濃度為1 mol/L，洗脫液精氨酸濃度為1 mol/L，洗脫液pH為10.5，洗脫液GSH/GSSG為5∶1。在此最佳復(fù)性條件下復(fù)性蛋白質(zhì)的溶栓比活為46 520 IU/mg，抗凝比活為9 980 ATU/mg。

表3 離子交換層析復(fù)性的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results of ion-exchange chromatography refolding

2.4 影響復(fù)性效果的因素

2.4.1 上樣量對復(fù)性效果的影響

如圖5所示，隨著上樣量的增加，復(fù)性蛋白質(zhì)的溶栓及抗凝比活都不斷降低。與稀釋復(fù)性相比，層析介導(dǎo)的體外復(fù)性技術(shù)雖能在較高蛋白質(zhì)終濃度條件下操作，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量超過一定值后，入柱蛋白質(zhì)會(huì)大量吸附于層析柱的上部，伸展的多肽鏈容易因?yàn)槭杷蕉纬删奂w從而造成復(fù)性率降低。

圖5 蛋白質(zhì)上樣量對復(fù)性效果的影響Fig.5 Effect of sample load on the renaturation of fusion protein.

2.4.2 洗脫液中精氨酸濃度對復(fù)性效果的影響

精氨酸是蛋白質(zhì)復(fù)性過程中常用的小分子輔助復(fù)性添加劑，它能有效抑制蛋白質(zhì)分子間的疏水聚集，從而提高復(fù)性率。其輔助不同蛋白質(zhì)復(fù)性的濃度稍有差別，通常為0.5～1.0 mol/L。如圖6所示，層析介導(dǎo)的復(fù)性蛋白液的溶栓及抗凝比活都隨著洗脫液中精氨酸濃度的增大而增大，當(dāng)洗脫液中精氨酸濃度為1 mol/L時(shí)達(dá)到最大，隨著精氨酸濃度的進(jìn)一步增大，活性逐漸降低。這可能是因?yàn)榫彼釢舛冗^高時(shí)，精氨酸所含胍基的變性作用居于主導(dǎo)地位，使復(fù)性蛋白活性降低。

2.4.3 流速對復(fù)性效果的影響

流速也是影響層析復(fù)性的一個(gè)因素。如圖7所示，0.6 mL/min為最佳的復(fù)性流速。過高的流速使得蛋白質(zhì)在層析柱中停留的時(shí)間過短，蛋白質(zhì)復(fù)性不夠完全。流速過低，蛋白質(zhì)在柱中停留時(shí)間過長，由于蛋白質(zhì)與介質(zhì)存在多點(diǎn)吸附，可能會(huì)使已經(jīng)復(fù)性好的蛋白質(zhì)重新失活反而造成蛋白復(fù)性率下降。

圖6 洗脫液中精氨酸濃度對復(fù)性效果的影響Fig.6 Effect of L-Arg concentration in eluent on the refolding of fusion protein.

2.5 稀釋及離子交換層析復(fù)性產(chǎn)物的凝膠過濾(SEC)分析

對于含有多對二硫鍵且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，要在復(fù)性過程中完全避免聚集體的產(chǎn)生存在一定難度。相比稀釋復(fù)性，層析復(fù)性可在一定程度上促進(jìn)正確折疊蛋白質(zhì)的生成，大幅度提高蛋白質(zhì)復(fù)性率。對層析及稀釋復(fù)性后的融合蛋白液進(jìn)行凝膠過濾分析(圖8)分別得到3個(gè)洗脫峰：P1、P2、P3。SDS-PAGE電泳分析表明 3個(gè)洗脫峰均為目標(biāo)蛋白。但對3個(gè)洗脫峰進(jìn)行活性測定發(fā)現(xiàn)只有P2表現(xiàn)出較高的溶栓及抗凝比活，因此推測P2為融合蛋白質(zhì)的正確折疊峰，而P1，P3為錯(cuò)誤折疊峰。對比發(fā)現(xiàn)，稀釋復(fù)性所得復(fù)性液中幾乎不含正確折疊峰，而層析復(fù)性所得復(fù)性液中正確折疊峰的含量明顯提高。

圖8 稀釋及離子交換層析復(fù)性后產(chǎn)物的SEC分析(F代表溶栓比活，單位IU/mg，A代表抗凝比活，單位ATU/mg)Fig.8 Size-exclusion chromatography curve of refolded fusion protein by dilution and chromatography.F represents specific fibrinolytic activity, unit is IU/mg; A represents specific anticoagulative activity, unit is ATU/mg.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，對于含有 9對二硫鍵的融合蛋白質(zhì)HV12p-rPA，Q Sepharose XL離子交換層析復(fù)性法是一種有效的復(fù)性方法。與稀釋復(fù)性相比，該方法能在相同蛋白質(zhì)終濃度(80.0 μg/mL)的條件下將復(fù)性蛋白質(zhì)的溶栓比活提高 14～15倍，抗凝比活提高 7～8倍，同時(shí)能大大縮短復(fù)性的時(shí)間(從稀釋復(fù)性的24 h縮短到1～2 h)并具有一定的純化作用。其成功輔助HV12p-rPA復(fù)性的主要因素如下：一是層析介質(zhì)的有效阻隔作用，能大幅度減少復(fù)性過程中聚集體的生成。當(dāng)帶電荷的變性蛋白質(zhì)進(jìn)入層析柱后，迅速被帶相反電荷的層析介質(zhì)吸附，從而被錨定在一定的介質(zhì)空間上。當(dāng)層析柱中的緩沖液由變性液逐漸變?yōu)閺?fù)性液時(shí)，蛋白質(zhì)開始折疊復(fù)性，由于層析介質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，層析復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的疏水聚集體明顯減少，正確折疊蛋白質(zhì)增加。同時(shí)層析介質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的復(fù)性動(dòng)力學(xué)過程，相比稀釋復(fù)性，能大幅度提高蛋白質(zhì)的復(fù)性速率。二是脲及精氨酸的輔助蛋白質(zhì)折疊作用。脲和精氨酸是稀釋復(fù)性常用的輔助蛋白質(zhì)復(fù)性添加劑。脲的主要作用是抑制蛋白質(zhì)的不可溶性疏水聚集，對蛋白質(zhì)的可溶性疏水聚集幾乎沒有抑制作用，而精氨酸的作用正好相反，其主要作用是抑制蛋白質(zhì)的疏水作用形成的可溶性寡聚體，二者在功能上互補(bǔ)，通過協(xié)同作用加強(qiáng)對蛋白質(zhì)復(fù)性過程中疏水相互作用的抑制，減少蛋白質(zhì)折疊中間體之間的疏水靠近，進(jìn)一步減少蛋白質(zhì)的共價(jià)聚集[15]。本研究中精氨酸在用作復(fù)性輔助添加劑的同時(shí)還可以代替氯化鈉等鹽作為洗脫劑，起到一箭雙雕的作用。三是脲及pH梯度的設(shè)置。脲梯度的設(shè)置可以充分發(fā)揮層析柱的作用，營造一個(gè)脲濃度呈線性變化的溫和環(huán)境，使得蛋白質(zhì)逐漸折疊復(fù)性，防止脲濃度的突然變化而造成蛋白質(zhì)復(fù)性的失敗。設(shè)置 pH梯度的目的在于使蛋白質(zhì)在復(fù)性的開始階段處于一個(gè)較低的pH環(huán)境之中，從而在蛋白質(zhì)還處于伸展?fàn)顟B(tài)時(shí)抑制錯(cuò)誤二硫鍵的形成，伴隨尿素的脫除，蛋白質(zhì)逐漸向天然空間結(jié)構(gòu)折疊的過程中，pH也呈線性上升，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)即將洗脫時(shí)，已有很大一部分蛋白質(zhì)分子已具有一定的天然構(gòu)象的空間結(jié)構(gòu)，此時(shí)溶液的pH已上升至10.5左右，可以促進(jìn)二硫鍵的形成。這樣在蛋白質(zhì)已形成一定天然構(gòu)象的基礎(chǔ)上再形成正確二硫鍵，此時(shí)形成正確二硫鍵的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于還處于未折疊狀態(tài)下形成的二硫鍵。四是洗脫緩沖液中氧化還原對(GSH/GSSG)的添置。對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，其復(fù)性過程和二硫鍵的形成及重排過程是緊密相連的，在復(fù)性的初級階段二硫鍵的形成是隨機(jī)的，容易形成錯(cuò)配體，它們需要通過分子內(nèi)重排形成天然結(jié)構(gòu)，該重排過程是整個(gè)復(fù)性過程的限速步驟。在二硫鍵的重排過程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)二硫鍵部分配對，形成類天然結(jié)構(gòu)的中間體，即無效折疊中間體，它們會(huì)妨礙蛋白質(zhì)進(jìn)一步氧化與折疊，這是造成復(fù)性率低的主要原因。氧化還原對(GSH/GSSG)的添加可以為二硫鍵的正確配對提供一個(gè)氧化還原環(huán)境，GSH可以還原錯(cuò)誤的或者正確配對的二硫鍵，并且催化二硫鍵的交換反應(yīng)，GSSG則參與交換反應(yīng)。只有當(dāng)GSH/GSSG保持一個(gè)適當(dāng)?shù)谋壤龝r(shí)，才可能最大限度地促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵的正確配對，而對于不同的蛋白質(zhì)這個(gè)最佳比例不同。對于層析法復(fù)性HV12p-rPA，GSH/GSSG最佳比例為 5∶1。本研究所建立的輔助含有 9對二硫鍵的融合蛋白質(zhì)HV12p-rPA成功復(fù)性的陰離子層析復(fù)性方法是以上 4個(gè)主要因素共同作用的結(jié)果。該方法對于其他含有多對二硫鍵蛋白質(zhì)的層析復(fù)性研究具有廣泛的借鑒意義。致謝：感謝中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的陳凈博士、汪音爵博士、彭飛博士等對本研究提供了寶貴的建議和支持！

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鑒于中國投資者不熟悉、不善于利用MIGA擔(dān)保制度的現(xiàn)狀，國家應(yīng)加大對中國投資者向MIGA投保的法律支持力度和服務(wù)引導(dǎo)力度，主要措施有：(1)在MIGA公約和《MIGA業(yè)務(wù)規(guī)則》基礎(chǔ)上，制定配套的國內(nèi)法律規(guī)則或指導(dǎo)規(guī)則，加大對中國投資者利用MIGA保險(xiǎn)的法律支持力度，使投資者的投保盡可能符合MIGA的擔(dān)保條件； (2)盡快確定中國投資者利用MIGA保險(xiǎn)的主管服務(wù)部門或機(jī)構(gòu)，制定中國投資者利用MIGA保險(xiǎn)的操作規(guī)程，加大實(shí)際操作層面的引導(dǎo)力度，為中國投資者利用MIGA保險(xiǎn)提供操作性保障。

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Weiquan Xie1,2, Guifeng Zhang2, Ling Gao1, Yongdong Liu2, Rong Yu1, and Zhiguo Su2
1 West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China 2 National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

Received:January 15, 2010;Accepted:April 28, 2010

Supported by:Open Foundation of National Key Laboratory of Biochemical Engineering(No.KF2008-7), National Natural Science Foundation of China(No.20976178).

Corresponding author:Rong Yu.Tel/Fax: +86-28-85503012; E-mail: yurong@scu.edu.cn生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(No.KF2008-7)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20976178)資助。