史懷，劉波，蘇明星，黃素芳，朱育菁

福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003

淡紫擬青霉胞外多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析

史懷，劉波，蘇明星，黃素芳，朱育菁

福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003

淡紫擬青霉 NH-PL-03菌株的胞外多糖粗提物對枯萎病病原菌-尖孢鐮刀菌具有較好的抑制效果，文中對淡紫擬青霉胞外多糖進行了分離純化和結(jié)構(gòu)分析，以期為其構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。采用乙醇沉淀法從淡紫擬青霉發(fā)酵液中提取粗多糖，經(jīng)Sevage法脫蛋白后，過Superdex-G75凝膠層析柱分離得到胞外多糖EP-1。紫外分光法和Sephacryl S-200 HR凝膠層析柱檢測EP-1為均一多糖，Sephacryl S-200柱層析測得EP-1的分子量為35.2 kDa，完全酸水解后紙層析檢測EP-1的單糖組成中僅有葡萄糖，紅外光譜、高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果表明EP-1的化學結(jié)構(gòu)是以β-(1,3)糖苷鍵連接而成的無分枝的葡聚糖。剛果紅絡(luò)合試驗表明EP-1在稀的堿溶液中以3股螺旋構(gòu)象存在。

淡紫擬青霉，多糖，結(jié)構(gòu)分析

Abstract:The paper dealt with the characterization of polysaccharide ofPaecilomyces lilacinusNH-PL-03 strain.First, we extracted and purified exude polysaccharide from the fungal fermentation broth by ethanol depositing method.Second, the proteins were removed by the Sevage method from the crude polysaccharide.Third, the purified polysaccharide(EP-1)was obtained after Superdex G-75 column separation.The results of UV-spectrometer and Sephacryl S-200 HR chromatography experiments showed that the EP-1 was a homogeneous pure polysaccharide with molecular weight of 35.2 kDa.Tested by paper chromatography analysis using the complete hydrolysis by sulfuric acid, we found that the EP-1 comprise single component as glucose.The chemical structure of EP-1 was confirmed as a kind of linear glucan linked by β-(1,3)linkage.The Congo red reaction performed that EP-1 probable presented a triple-helica conformation in the dilute alkali.

Keywords:Paecilomyces lilacinus, polysaccharide, structure analysis

淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson屬半知菌綱、絲孢菌目、擬青霉屬，對多種植物寄生線蟲有著良好的防治效果[1-2]、此外還具有殺蟲[3]、促長[4]、拮抗[5]、降解[6]等多種功效，是極具推廣潛力的生防菌與功能菌。淡紫擬青霉生物學功能與其次生代謝物關(guān)系密切，該菌不但能分泌對線蟲具有毒殺作用的毒素[7-8]，還能分泌吲哚乙酸[9]、以及蛋白酶、淀粉酶、右旋糖苷酶等多種酶類[10-11]。國內(nèi)對淡紫擬青霉在植物線蟲及病害生物防治上的應(yīng)用進行了廣泛的研究，但對菌株所產(chǎn)生的各種次生代謝物的提取及結(jié)構(gòu)、功能等深層次的研究十分薄弱。本實驗室在先期工作中篩選到一株對尖孢鐮刀菌具有拮抗抑制作用的淡紫擬青霉菌株NH-PL-03，對抗性物質(zhì)進行了初步的篩選分析，結(jié)果表明其抑菌活性來自胞外多糖的粗提物[12]。

微生物多糖是目前生物發(fā)酵工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一大研究熱點。多糖及其復(fù)合物在生命活動中有著極其重要的生物功能，但由于多糖本身的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很多特殊的生物活性都與其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，因此對多糖結(jié)構(gòu)的研究是開發(fā)利用糖類物質(zhì)的關(guān)鍵。

擬青霉屬真菌的多糖國內(nèi)外研究報道多為醫(yī)藥方面，如古尼擬青霉、細腳擬青霉、蟬擬青霉等菌株的胞外多糖經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗肝炎病毒等作用[13-15]。但關(guān)于淡紫擬青霉多糖的活性及結(jié)構(gòu)方面的研究尚未見他人報道。

本研究對淡紫擬青霉胞外多糖進行提取、分離、純化后，對多糖的結(jié)構(gòu)進行了分析，為明確其構(gòu)效關(guān)系、推斷抑菌機理，以及更好地開發(fā)利用淡紫擬青霉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：淡紫擬青霉NH-PL-03菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基(蔗糖 3%，NaNO30.3%，KCl 0.05%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，F(xiàn)eSO40.001%，pH自然)。

試劑：葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖標準品均為Sigma公司產(chǎn)品；層析分離材料Superdex G-75、Sephacryl S-200 HR葡聚糖凝膠均為Pharmacia公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取、分離和純化

淡紫擬青霉搖床培養(yǎng)7 d后收集發(fā)酵液，8 000 r/min離心15 min，取上清液。上清液加入3倍體積的95%乙醇沉淀過夜，2 000 r/min離心30 min，收集沉淀，依次用丙酮、乙醚洗滌數(shù)次后真空干燥即得多糖粗提物。Sevage法[16]初步純化去除多糖粗提物中的游離蛋白質(zhì)后，多糖溶液經(jīng)逆向流水透析48 h，蒸餾水透析24 h后，用3倍體積95%乙醇醇析過夜，2 000 r/min離心30 min，收集沉淀，無水乙醇沖洗后真空干燥即得淡紫擬青霉胞外粗多糖。

Superdex G-75裝柱(1.6 cm×60 cm)，粗多糖上柱后以0.2 mol/L的NaCl溶液洗脫，流速24 mL/h，酚-硫酸法檢測，收集最大洗脫峰，真空冷凍干燥得到多糖EP-1。

1.2.2 多糖的純度鑒定

紫外光譜分析：多糖樣品EP-1溶解于0.2 mol/L的NaOH，200～400 nm區(qū)間掃描。

Sephacryl S-200 HR 凝膠層析：Sephacryl S-200 HR裝柱(1.6 cm×80 cm)，樣品上柱后以0.2 mol/L的NaCl溶液洗脫，流速12 mL/h，酚-硫酸法檢測多糖峰位。

1.2.3 分子量測定[17]

采用Sephacryl S-200 HR層析柱(操作條件同上)，取T系列標準葡聚糖上柱，0.2 mol/L NaCl溶液洗脫，各測得洗脫體積Ve，用藍色葡聚糖 T2000上柱，測得洗脫體積V0。根據(jù)Ve/V0與分子量對數(shù)值logM·W測出標準曲線。相同濃度待測樣品于同樣條件上柱，據(jù)其Ve/V0值從標準曲線上查算分子量。

1.2.4 多糖組成分析

EP-1多糖樣品 5 mg加入 2 mol/L的 H2SO44.5 mL，封管，100℃水解8 h，BaCO3中和，離心取上清，濃縮后作紙層析。以葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖標準品為對照，乙酸乙酯∶吡啶∶水=10∶4∶3(V/V)為展開劑，苯胺-鄰苯二甲酸顯色，105℃烘干5 min。

1.2.5 多糖結(jié)構(gòu)分析

紅外光譜分析：取EP-1多糖樣品2 mg與100 mg干燥的 KBr粉末于瑪瑙研缽中在紅外燈下磨勻壓片，紅外光譜儀于4 000～400 cm?1波長區(qū)間內(nèi)掃描。

高碘酸氧化及甲酸測定[18]：EP-1樣品50 mg，加去離子水 50 mL，磁力充分攪拌，使樣品的懸浮液均勻，然后加入30 mmol/L NaIO425 mL，定容，使NaIO4終濃度為15 mmol/L。置于暗處反應(yīng)，每隔6 h取樣0.1 mL，蒸餾水稀釋250倍，分光光度計測定223 nm處光密度值至恒定為止(蒸餾水為空白對照)。加一滴乙二醇終止反應(yīng)，高碘酸氧化完成。查標準曲線，計算高碘酸消耗量。取上述氧化液2 mL，加1滴溴甲酚紫為指示劑，0.0045225 mol/L NaOH滴定，計算甲酸生成量。

Smith降解：乙二醇處理后的溶液透析48 h，濃縮，加入NaBH4還原過夜。50% HAc中和至pH為6～7，去離子水透析48 h。透析液加入等體積的1 mol/L H2SO4，25℃水解40 h，BaCO3中和至pH為6，過濾后透析48 h，袋外部分干燥做G.C.分析，袋內(nèi)加乙醇醇析，離心，上清及沉淀部分干燥后分別進行G.C.分析。G.C.條件：HP-5石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，恒流模式，流量 1 mL/min，程序升溫為：以3℃/min從120℃升到210℃，保持4 min。進樣口采用不分流模式，溫度250℃，載氣為氮氣，檢測器溫度300℃，氮、氫、空氣的流速分別為25、30、400 mL/min。進樣量 1 μL。

剛果紅結(jié)合實驗分析[18]：5 mg EP-1樣品，加入2 mL去離子水和2 mL 80 μmol/L剛果紅試劑，逐漸加4 mol/L NaOH溶液，使溶液的堿濃度由0 mol/L增加到0.4 mol/L，然后紫外掃描，測不同堿濃度條件下的最大光吸收波長。

1.2.6 淡紫擬青霉胞外多糖的生物活性測定

EP-1溶解于0.2 mol/L的NaOH中，將PDA固體培養(yǎng)基熔化后冷卻至 45℃左右，迅速添加 EP-1溶液并充分搖勻，使其終濃度為200 μg/mL，制成平板。以同濃度的NaOH溶液為空白對照。用 6 mm打孔器從長勢旺盛的尖孢鐮刀菌平板上打取菌餅，并各移 1塊菌餅倒扣在上述制備的平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d后取出觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的提取、分離和純化

發(fā)酵上清液中加入95%乙醇后立即產(chǎn)生暗綠色膠團狀凝集物，其內(nèi)裹有大量氣泡浮于溶液表面，離心后得到果凍狀凝膠，該提取物具有多糖常見的各種顏色反應(yīng)，可溶于堿液，在水及酸中基本不溶。多糖粗提物經(jīng)Sevage法脫蛋白并透析后，冷凍干燥獲得的粗多糖樣品呈淡黃色粉末狀。粗多糖經(jīng)Superdex G-75柱層析純化得到3個洗脫峰(圖1)，收集最大洗脫峰并真空冷凍干燥后得到白色粉末，將其命名為EP-1。

圖1 胞外粗多糖的Superdex G-75柱層析圖譜Fig.1 Chromatogram of the crude exo-polysacharides on Superdex G-75 column.

在實驗過程中觀察到淡紫擬青霉胞外多糖EP-1具有凝膠多糖的特性，即多糖的堿溶液在透析和中和過程中均可以形成微凝膠狀，不易攪碎、破壞凝膠狀態(tài)，用堿溶解后可以恢復(fù)溶液狀；加熱過程中可以形成有一定強度的凝膠，高溫(＞80℃)下形成的凝膠不可逆。

2.2 多糖的純度鑒定

2.2.1 紫外光譜分析

EP-1溶液在紫外光波長260 nm與280 nm處均無顯著吸收峰，說明樣品中已基本去除蛋白質(zhì)、多肽、核酸類等雜質(zhì)(圖2)。

圖2 EP-1樣品的紫外光譜Fig.2 Ultraviolet spectrum of EP-1.

2.2.2 凝膠柱層析

多糖的洗脫收集液用酚-硫酸法檢測，得到的洗脫峰為單一的對稱峰(圖3)，表明EP-1多糖為均一多糖。

圖3 EP-1樣品的Sephacryl S-200 HR柱層析圖譜Fig.3 Chromatogram of the sample EP-1 on Sephacryl S-200 HR column.

2.3 多糖的分子量測定

根據(jù)T-系列標準葡聚糖制作的標準曲線，求得EP-1的分子量為35.2 kDa(圖4)。

2.4 多糖的組成分析

EP-1水解產(chǎn)物與標準單糖的紙層析圖譜表明：EP-1的單糖組成只有葡萄糖，不含果糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖，可見EP-1是一種單一單糖組分的葡聚糖(圖5)。

圖4 多糖分子量標準曲線Fig.4 Standard curve of polysaccharides molecular weight.

圖5 EP-1水解產(chǎn)物的紙層析圖譜Fig.5 Paper chromatogram of EP-1.A: rhamnose; B:galactose; C: mannose; D: glucose; E: hydrolysate of EP-1.

2.5 多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 紅外光譜結(jié)果分析

EP-1樣品的紅外光譜顯示了多糖的特征吸收峰：3 405 cm?1處的吸收峰為-OH的伸縮振動吸收峰，2 925 cm?1處的吸收峰為C-H的伸縮振動吸收峰，1 373 cm?1處的吸收峰為C-H變角振動吸收峰，1 315 cm?1處的吸收峰為 C-H彎曲振動吸收峰，1 162 cm?1處的吸收峰為環(huán)上的C-O吸收峰，889 cm?1處的特征吸收峰表示了 EP-1為 β-D-吡喃型糖苷鍵構(gòu)型；800～870 cm?1處無吸收峰，表明無甘露聚糖存在；1 650～1 550 cm?1之間無吸收峰，表明無明顯氨基存在(圖6)。

圖6 EP-1的紅外光譜Fig.6 Infrared spectrum of EP-1.

圖7 不同濃度NaOH溶液中EP-1樣品與剛果紅絡(luò)合物最大吸光值的變化Fig.7 Change in the absorption maximum of the Congo Red-sample complex at various concentrations of NaOH.

2.5.2 高碘酸氧化及甲酸測定

用NaIO4對IP-1及EP-1樣品進行選擇性定性氧化實驗，間隔時間取樣，發(fā)現(xiàn)其紫外吸收數(shù)值始終保持恒定不變，并且用NaOH溶液滴定沒有發(fā)現(xiàn)甲酸生成。以上結(jié)果表明EP-1樣品是以不消耗NaIO4的葡萄糖殘基以1→3糖苷鍵方式連接而成的直鏈葡聚糖。

2.5.3 Smith降解

經(jīng)透析后袋內(nèi)物質(zhì)醇析仍然有大量沉淀產(chǎn)生，而袋外部分用 G.C.分析未檢測出任何物質(zhì)。Smith降解的結(jié)果同樣驗證了 EP-1由高碘酸氧化不能打斷的1→3糖苷鍵方式連接而成。

2.5.4 剛果紅結(jié)合實驗分析

NaOH濃度較小時，溶液的紫外吸收移向長波，表明EP-1樣品能與剛果紅形成絡(luò)合物，樣品呈有規(guī)則的螺旋構(gòu)象；NaOH濃度增大到一定程度，最大吸收波長下降，多糖的螺旋結(jié)構(gòu)解體，變成無規(guī)則的線團形式(圖7)。即 EP-1在弱堿性范圍內(nèi)可形成有序的3股螺旋結(jié)構(gòu)，在強堿性條件下，分子間的氫鍵被破壞，3股螺旋結(jié)構(gòu)解體為單股，不能與剛果紅形成絡(luò)合物。通常的凝膠多糖分子量在40～77 kDa之間，容易形成3股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.5.5 多糖結(jié)構(gòu)還原

EP-1樣品完全酸水解后的紙層析和高碘酸氧化實驗、Smith降解實驗均確定多糖 EP-1是以 1→3葡萄糖苷鍵連接的單糖組分單一的無分支結(jié)構(gòu)的多聚葡萄糖；Sephacryl S-200 HR凝膠層析求得EP-1樣品的平均分子量為35.2 kDa；紅外光譜分析證明，EP-1樣品的紅外光譜顯示了多糖的特征吸收峰，890 cm?1處的特征峰表示了該多糖的糖苷鍵為 β-吡喃型糖苷鍵構(gòu)型。與剛果紅試劑形成的絡(luò)合物其紫外吸收波長隨NaOH濃度變化而變化的構(gòu)象檢測表明EP-1樣品在稀堿溶液中(濃度＜0.3 mol/L)可能存在3股螺旋構(gòu)象。

綜上所述，可知淡紫擬青霉胞外多糖EP-1的結(jié)構(gòu)式可以圖8表示，其中n代表聚合度，約為195。

圖8 EP-1的結(jié)構(gòu)式Fig.8 Structural formula of EP-1.

2.6 多糖的生物活性測定

對照組尖孢鐮刀菌菌落呈白色絮狀，菌絲致密飽滿，幾乎布滿整個平板(圖9A)。鏡檢觀察可見菌絲細胞質(zhì)均勻、直長、少分支、節(jié)間較長、有卵形分生孢子產(chǎn)生。

培養(yǎng)基中添加EP-1多糖處理的尖孢鐮刀菌，其生長受到抑制，菌絲稀疏，氣生菌絲圍繞中央的菌餅呈簇狀分布，在菌絲團的間隙間可見壞死的菌絲緊貼在培養(yǎng)基表面，呈黑色(圖9B)。鏡檢可見受抑制的菌絲生長異常，多處局部膨大，壞死的菌絲細胞質(zhì)嚴重濃縮，部分菌絲消解，胞內(nèi)物質(zhì)溢出，未觀察到孢子產(chǎn)生。粗多糖對尖孢鐮刀菌的抑制能力更強，可使尖孢鐮刀菌菌絲大面積壞死，在菌落上形成黑斑(圖9C)。

圖9 淡紫擬青霉多糖對尖孢鐮刀菌的抑制活性Fig.9 Inhibition activity ofPaecilomyces lilacinuspolysaccharide toF.oxysporum.(A)The control group.(B)Adding EP-1 to the medium.(C)Adding crude exopolysacharides to the medium.

與未純化的粗多糖相比，EP-1對鐮刀菌菌落生長的抑制能力略低，推測Superdex G-75層析分離時獲得的另外 2個低含量的組分也對鐮刀菌具有一定的抑制能力。

3 討論

到目前為止，從真菌中分離得到的多糖有幾十種，可分為聚糖、雜多糖、蛋白糖和肽糖，糖的種類與真菌種屬間無明顯的相關(guān)性。近年研究報道的真菌多糖以葡聚糖居多。Mondal等[19]從食用蘑菇Termitomyces eurhizus的子實體中得到2個多糖PS-I和 PS-II，均為 α-葡聚糖，其中 PS-I結(jié)構(gòu)主鏈由α-(1,6)-D-葡萄糖和 α-(1,3)-D-葡萄糖按 2.5:1的比例組成，無分枝；PS-II則為 α-(1,6)-D-葡聚糖。陸榕等[20-21]提取出細腳擬青霉Paecilomyces tenuipes粗多糖，純化后經(jīng)研究確定了細腳擬青霉多糖 I為α-(1,6)連結(jié)的無分枝的葡聚糖，相對分子量為2.05×104，細腳擬青霉多糖 II 則以 β-(1,6)-D-葡聚糖為主鏈，β-(1,6)-D-甘露糖和 β-(2,6)-D-半乳糖組成側(cè)鏈。

淡紫擬青霉胞外多糖 EP-1的結(jié)構(gòu)為以 β-(1,3)糖苷鍵連接而成的無分枝的葡聚糖。此前報道的此類結(jié)構(gòu)的多糖被稱為凝膠多糖(又名Curdlan多糖、熱凝多糖)，目前發(fā)現(xiàn)的凝膠多糖為糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes faecalisvar.myxogenes或土壤桿菌Agrobacteriumspecies所產(chǎn)生[22]，由于其獨特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，具有多種生理活性與應(yīng)用價值。作為食品添加劑，可用于改善加工食品的粘彈性、穩(wěn)定性、保濕性、抗冷凍性及增稠性等，并可制成可食的生物可降解膜[23]；作為免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤[24]、降血脂、降膽固醇[25]的作用；此外，經(jīng)硫酸化修飾的凝膠多糖可用于抗人類HIV病毒[26]。真菌特別是淡紫擬青霉產(chǎn)生此類結(jié)構(gòu)的多糖以及該多糖對尖孢鐮刀菌的抑菌活性尚未見報道。

多糖是極其復(fù)雜的多聚體，具有微觀不均勻一性等特點，即使不同來源的相同多糖其構(gòu)象、理化性質(zhì)乃至生物活性及其作用機理也可能不同。如不同來源的β-(1,3)-D-葡聚糖，化學組成雖然相同，但分子大小和空間構(gòu)象相差很大。黑木耳 β-(1,3)-D-葡聚糖為單股螺旋，香菇β-(1,3)-D-葡聚糖為三股螺旋，虎奶菇β-(1,3)-D-葡聚糖為柔順鏈，而它們的生物活性相差很大[27]。本研究結(jié)果表明淡紫擬青霉胞外多糖EP-1在稀堿溶液中以三股螺旋的構(gòu)象存在，該多糖對尖孢鐮刀菌具有較高的抑菌活性。這種由淡紫擬青霉所產(chǎn)生的凝膠多糖的發(fā)現(xiàn)，表明淡紫擬青霉不僅在植物病害的生物防治領(lǐng)域具有推廣價值，同時在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域也展現(xiàn)出一定的開發(fā)利用前景。

現(xiàn)有的結(jié)果表明，高級結(jié)構(gòu)對多糖的影響非常大，X-衍射結(jié)果顯示三股螺旋結(jié)構(gòu)是真菌多糖最具活性的空間構(gòu)象[28]。如天然香菇多糖的高級結(jié)構(gòu)與其抗腫瘤活性密切相關(guān)，當在香菇多糖溶液中加入脲、胍等變性劑，改變其三股螺旋立體構(gòu)型，其抗腫瘤免疫活性消失[29-30]；向水不溶性的裂摺菌多糖種添加尿素或NaOH，則可誘導(dǎo)產(chǎn)生三股螺旋構(gòu)象，從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性[31]。但并不是所有多糖其螺旋結(jié)構(gòu)與活性存在必然關(guān)系，如有研究表明灰樹花多糖[32]以及從Glomerella cingulata的培養(yǎng)液中分離出的 β-(1,3)-D-葡聚糖(Glomerellan)[33]，其抗腫瘤活性均與有序結(jié)構(gòu)無關(guān)。淡紫擬青霉胞外多糖EP-1對生存能力很強的枯萎病原尖孢鐮刀菌具有很好的抑制作用，但該多糖的抑菌能力是否與其螺旋結(jié)構(gòu)之間存在關(guān)聯(lián)還有待于進一步的研究。

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Isolation, purification and structure analysis of polysaccharides from Peacilomyces lilacinus

Huai Shi, Bo Liu, Mingxing Su, Sufang Huang, and Yujing Zhu
Agricultural Bioresources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China

Received:February 4, 2010;Accepted:May 6, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA10A211), Natural Science Foundation of Fujian Province of China(No.2008J0320).

Corresponding author:Bo Liu.Tel: +86-591-87884601; E-mail: fzliubo@163.com國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2006AA10A211)，福建省自然科學基金項目(No.2008J0320)資助。