劉興茂，劉紅，葉玲玲，李世崇，吳本傳，王海濤，謝靖，陳昭烈

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

CHO 工程細(xì)胞(11G-S)懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的設(shè)計

劉興茂，劉紅，葉玲玲，李世崇，吳本傳，王海濤，謝靖，陳昭烈

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

以懸浮適應(yīng)的表達(dá)重組尿激酶原(Pro-urokinase，pro-UK)CHO工程細(xì)胞系11G-S為對象，采用Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，設(shè)計支持 CHO工程細(xì)胞(11G-S)懸浮生長的無血清培養(yǎng)基。以細(xì)胞密度為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman實驗設(shè)計對影響細(xì)胞生長的培養(yǎng)基添加成分進(jìn)行考察，確定了3種對細(xì)胞生長明顯促進(jìn)作用的培養(yǎng)基添加成分：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及腐胺。繼而利用響應(yīng)面法分析了這 3種添加成分的最佳水平范圍，設(shè)計了一種適用于CHO工程細(xì)胞(11G-S)懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基SFM-CHO-S。11G-S細(xì)胞在 SFM-CHO-S批次懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞最大生長密度達(dá)到4.12×106cells/mL，pro-UK的最大累積活性達(dá)到5 614 IU/mL，培養(yǎng)效果優(yōu)于商品化的同類無血清培養(yǎng)基。

CHO工程細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)基，實驗設(shè)計

Abstract:With suspension adapted recombinant Chinese hamster ovary(CHO)cell lines 11G-S expressing human pro-urokinase(pro-UK)as the object of study, a serum-free medium for the cultivation of recombinant CHO cells in suspension was formulated by using Plackett-Burman design and response surface methodology.The two-level Plackett-Burman design was used to evaluate the effect of 10 medium supplements on the growth of the 11G-S cells in suspension culture.Among the 10 medium supplements,insulin, transferrin, and putrescine were identified as the most significant factors(P＜0.05).The response surface methodology with three factors and three levels was used to determine the optimal levels of these factors.And a serum-free medium, SFM-CHO-S for recombinant CHO cells suspension culture was formulated.The maximum cell density of 11G-S cells in SFM-CHO-S in suspension batch culture reached 4.12×106cells/mL with a maximum pro-UK activity at 5 614 IU/mL, which was superior to the commercial serum-free medium for recombinant CHO cells.

Keywords:recombinant Chinese hamster ovary cells, suspension culture, serum-free medium, medium design

CHO工程細(xì)胞是目前用于包括工程抗體和重組蛋白在內(nèi)的生物技術(shù)藥物研發(fā)和生產(chǎn)的最重要的表達(dá)系統(tǒng)[1-2]。懸浮培養(yǎng)是哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究和應(yīng)用的重要模式和首要選擇[3-4]。對于 CHO工程細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)而言，培養(yǎng)基是影響細(xì)胞生長和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物生產(chǎn)的最重要因素之一。

受動物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品生產(chǎn)過程優(yōu)化和產(chǎn)品安全性要求的驅(qū)動，無血清培養(yǎng)已成為目前哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展方向和應(yīng)用趨勢[5]。隨著人們對體外培養(yǎng)細(xì)胞代謝和生理學(xué)了解的不斷深入以及調(diào)控細(xì)胞生長代謝和分化的細(xì)胞因子種類及來源的豐富，為動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究和應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)[6]。目前商品化的CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基存在如下現(xiàn)狀：大多以液體的形式提供、價格昂貴、培養(yǎng)基成分配方，這一定程度上限制了它的實際應(yīng)用。本研究以懸浮適應(yīng)的表達(dá)重組尿激酶原(Pro-urokinase，pro-UK)CHO工程細(xì)胞系11G-S為對象，采用Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，設(shè)計了一種適合CHO工程細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基SFM-CHO-S。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞系

懸浮適應(yīng)的表達(dá) pro-UK CHO工程細(xì)胞系11G-S[7]由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所構(gòu)建、保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

DMEM/F12(V/V，1∶1)培養(yǎng)基和 SFM-CHO培養(yǎng)基購自Hyclone公司。

1.1.3 培養(yǎng)基添加物

小牛血清購于蘭州民海公司。谷氨酰胺、Pluronic F-68、胰島素、腐胺、谷胱甘肽、抗壞血酸、?-巰基乙醇、亞硒酸鈉、硫酸銅及硫酸鋅購自Sigma公司。轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗壞血酸及卵磷脂為Merck公司產(chǎn)品。乙醇胺購于 ACPOS公司。硫酸葡聚糖購于Wako公司。硫酸錳、鉬酸、偏釩酸銨及檸檬酸鐵購于北京化學(xué)試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

11G-S 細(xì)胞以 3×105～3.5×105cells/mL 接種于100 mL三角瓶內(nèi)，培養(yǎng)體積35 mL，培養(yǎng)時加入含5 mmol/L谷氨酰胺、0.1%(W/V)Pluronic F-68及25 μg/mL硫酸葡聚糖的無血清培養(yǎng)基或含 1%(V/V)小牛血清的 DMEM/F12。將三角瓶置于 37℃溫箱中搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min。

1.2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計

應(yīng)用 SAS軟件進(jìn)行實驗次數(shù)n=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計及統(tǒng)計分析，以細(xì)胞生長密度為響應(yīng)值，考察胰島素、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、微量元素(含7種成分)、β-巰基乙醇，卵磷脂、抗壞血酸、谷胱甘肽、乙醇胺及β-環(huán)狀糊精等10種培養(yǎng)基添加成分種對11G-S細(xì)胞生長的影響，實驗設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素及水平Table 1 Range of different factors investigated with Plackeet-Burman

1.2.3 響應(yīng)面中心組合和設(shè)計

由Box和Wilson開發(fā)的Box-behnken是一種常用的響應(yīng)面設(shè)計方法，可以通過最少的實驗來擬合響應(yīng)面模型，可以對篩選出的關(guān)鍵因素進(jìn)行量化。應(yīng)用SAS軟件，采用Box-behnken方法，進(jìn)一步研究由Plackett-Burman篩選出的3個具有促進(jìn)11G-S細(xì)胞生長作用的重要因素(胰島素、腐胺及轉(zhuǎn)鐵蛋白)，以確定其最佳使用劑量。根據(jù)響應(yīng)面中心復(fù)合實驗設(shè)計原理，以細(xì)胞生長密度為響應(yīng)值，設(shè)計 3因素3水平共15個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，各自變量水平見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計的因素及水平Table 2 Values of independent variables at different levels of central composite design

1.2.4 細(xì)胞密度、存活率及pro-UK活性的測定

采用 Cedex AS20細(xì)胞密度和存活率自動分析系統(tǒng)(Innovatis，Germany)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和存活率分析。采用體外纖維蛋白瓊脂板溶圈法檢測pro-UK體外纖維蛋白溶解活性[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 無血清培養(yǎng)基添加成分的篩選

設(shè)計無血清培養(yǎng)基組成配方的技術(shù)核心是篩選和確定具有促進(jìn)細(xì)胞生長、維持細(xì)胞存活、提高目的基因表達(dá)作用的培養(yǎng)基添加成分。由于動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)設(shè)計中涉及的添加成分較多，且不同添加成分之間可能存在交互作用，統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計成為無血清培養(yǎng)基設(shè)計的主要方法[9-10]。Plackett-Burman設(shè)計作為一種以不完全平衡塊為原理的統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計方法，能夠從眾多變量中快速、有效地篩選出最重要的一些因素，以進(jìn)行進(jìn)一步的研究，并且具有數(shù)據(jù)處理簡單、適用于多個因素等優(yōu)點，常用于培養(yǎng)基優(yōu)化和設(shè)計早期階段的篩選實驗[11-12]。

Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果見表 3。運(yùn)用SAS軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，從表4中各因素的P值可以看出胰島素(X1)、腐胺(X2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(X3)、微量元素(X4)、谷胱甘肽(X8)和乙醇胺(X9)這6因素在α=0.05的水平上對11G-S細(xì)胞生長具有顯著的正向影響效應(yīng)；卵磷脂(X6)及 β-環(huán)狀糊精(X10)對 11G-S細(xì)胞生長的影響作用較弱；而抗壞血酸(X5)、β-巰基乙醇(X7)對細(xì)胞生長具有較強(qiáng)的反向影響效應(yīng)。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基配比

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及響應(yīng)值

由Plackett-Burman實驗可知，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和腐胺是對11G-S細(xì)胞正向影響效應(yīng)最為顯著的3個因素。為了進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，以胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和腐胺為自變量，以細(xì)胞最大生長密度為響應(yīng)值，利用SAS軟件進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計及統(tǒng)計分析。實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值(n = 12)Table 3 Experimental design and response values of Plackett-Burman(n = 12)

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table 4 Partial regression coefficients and analysis of response values significance

表5 響應(yīng)面設(shè)計及響應(yīng)值Table 5 Central composite design and response values

2.2.2 二次回歸擬合及方差分析

應(yīng)用SAS8.0軟件對表5的響應(yīng)值進(jìn)行分析得到擬合全變量二次回歸方程，各變量的偏回歸系數(shù)估計值及方差分析結(jié)果見表 6。得到擬合全變量二次回歸方程為：

其中，Y為細(xì)胞最大生長密度(106cells/mL)。

回歸各項的方程分析結(jié)果表明：X1、X2、X3的一次項和二次項影響都是顯著的，但 3個自變量之間的交互效應(yīng)較小。決定系數(shù)R2為0.9502，說明這3個因素能解釋Y變化的95.02%，模型擬合程度較好。因此，可用上述模型對11G-S細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長密度進(jìn)行分析和預(yù)測。

表6 二次回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 6 Coefficient estimate by the regression quadratic model

2.2.3 響應(yīng)面各因素的交互作用

借助 SAS8.0軟件對上述回歸方程所作的等高線圖和響應(yīng)曲面圖見圖1～3。各變量及其交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過該圖組直觀地反映出來。

圖1顯示了當(dāng)轉(zhuǎn)鐵蛋白位于中心水平時，胰島素與腐胺對細(xì)胞密度的交互作用等高線圖及響應(yīng)面圖。等高線圖顯示了細(xì)胞密度隨著胰島素及腐胺濃度的變化趨勢，當(dāng)胰島素及腐胺濃度分別為 2.75～4.25 mg/L和0.45～0.9 mg/L時，最大細(xì)胞密度達(dá)到4.08×106cells/mL。從響應(yīng)面圖可以看出，胰島素濃度變化對細(xì)胞密度變化的影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的坡度較陡，腐胺濃度變化對細(xì)胞密度變化的影響較小，響應(yīng)曲面的坡度較緩。

圖2顯示了當(dāng)腐胺位于中心水平時，胰島素與轉(zhuǎn)鐵蛋白對細(xì)胞密度的交互作用等高線圖及響應(yīng)面圖。等高線圖顯示細(xì)胞密度隨著胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的變化趨勢，當(dāng)胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度分別介于2.8～4.5 mg/L和5～7.5 mg/L時，最大細(xì)胞密度達(dá)到4.08×106cells/mL。從響應(yīng)面圖可以看出，胰島素濃度變化及轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度變化對細(xì)胞密度變化的影響效果大體相近，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的坡度下降趨勢相近。

圖3顯示了當(dāng)胰島素位于中心水平時，腐胺與轉(zhuǎn)鐵蛋白對細(xì)胞密度的交互作用等高線圖及響應(yīng)面圖。等高線圖顯示細(xì)胞密度隨著腐胺及轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的變化趨勢，當(dāng)腐胺及轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度分別介于0.57～0.87 mg/L、5.2～7 mg/L之間時，培養(yǎng)最大細(xì)胞密度可以達(dá)到4.08×106cells/mL；從響應(yīng)面圖可以看出，轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度變化對細(xì)胞密度變化的影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的坡度較陡，腐胺濃度變化對細(xì)胞密度變化的影響較小，響應(yīng)曲面的坡度較緩。

圖1 胰島素與腐胺交互作用影響細(xì)胞生長密度的等高線圖(A)及響應(yīng)面圖(B)Fig.1 Contour line(A)and surface(B)of mutual-influence for insulin and putrescine on the growth of 11G-S cells.

圖2 胰島素與轉(zhuǎn)鐵蛋白交互作用影響細(xì)胞生長密度的等高線圖(A)及響應(yīng)面圖(B)Fig.2 Contour line(A)and surface(B)of mutual-influence for insulin and transferrin on the growth of 11G-S cells.

2.3 11G-S細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果

圖4 11G-S細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長及pro-UK的產(chǎn)量Fig.4 Growth and pro-UK production of 11G-S cells in different media.(A)◆: density of cells cultured in DMEM/F12 medium with 1% serum; ■: density of cells cultured in SFM-CHO-S medium; ▲: density of cells cultured in SFM-CHO medium; +: viability of cells cultured in DMEM/F12 medium with 1% serum; ×: viability of cells cultured in SFM-CHO-S medium; *: viability of cells cultured in SFM-CHO medium.(B)□: activity of pro-UK cultured in DMEM/F12 medium with 1% serum; ■: activity of pro-UK cultured in SFM-CHO-S medium; ■: activity of pro-UK cultured in SFM-CHO medium.

在相同的懸浮培養(yǎng)條件下，比較了CHO細(xì)胞在含1%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、本研究設(shè)計的無血清培養(yǎng)基 SFM-CHO-S及商品化的無血清培養(yǎng)基SFM-CHO的培養(yǎng)效果。11G-S細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，最大活細(xì)胞密度分別達(dá)到2.5×106cells/mL、4.2×106cells/mL 及 3.3×106cells/mL，隨后活細(xì)胞密度逐漸降低(圖4A)。3種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活率呈現(xiàn)大致相同的變化趨勢，在細(xì)胞生長的對數(shù)期細(xì)胞維持較高的活率，隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞存活率逐漸降低。pro-UK的蛋白活性在培養(yǎng)的第6天達(dá)到高峰，分別為 3513 IU/mL、5614 IU/mL及4537 IU/mL(圖4B)。實驗結(jié)果表明，SFM-CHO-S的11G-S細(xì)胞培養(yǎng)效果不僅優(yōu)于有血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，也優(yōu)于商品化的同類無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。

3 結(jié)論

由于在無血清培養(yǎng)設(shè)計中，需要添加的血清替代成分往往較多，且不同組成成分對 CHO(11G-S)細(xì)胞生長及代謝的影響是不同的。因此在進(jìn)行無血清培養(yǎng)基設(shè)計時，根據(jù)動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基相關(guān)文獻(xiàn)的報道，以商業(yè)化的DMEM/F12(1∶1，V/V)作為無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并從眾多的添加物中選取了17種物質(zhì)，主要包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺、乙醇胺、β-巰基乙醇等常用的幾種添加劑，另外也選取了一些對細(xì)胞具有特殊功效作用的添加物，主要包括 β-環(huán)狀糊精、金精三羧酸、生育酚、氫化可的松等。為了便于培養(yǎng)基的設(shè)計，首先進(jìn)行了單組分添加物培養(yǎng)實驗，通過實驗初步剔除了對細(xì)胞生長有抑制作用的成分，篩選出了對細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用的10種物質(zhì)。

在設(shè)計適用于 CHO工程細(xì)胞(11G-S)懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基時，應(yīng)用Plackett-Burman實驗設(shè)計，對影響表達(dá)pro-UK的CHO工程細(xì)胞系11G-S生長的10種培養(yǎng)基添加成分進(jìn)行了評價。其中，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及腐胺對11G-S細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)具有非常顯著的生長促進(jìn)作用。在Plackett-Burman實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及腐胺的最佳使用劑量，設(shè)計了一種適用于CHO工程細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基 SFM-CHO-S。11G-S細(xì)胞在 SFM-CHO-S批次懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞最大生長密度達(dá)到4.12×106cells/mL，pro-UK的最大累積活性達(dá)到了5 614 IU/mL，培養(yǎng)效果優(yōu)于商品化的同類無血清培養(yǎng)基。

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以集體記憶呼喚國際文化認(rèn)同。侵華日軍南京大屠殺遇難同胞紀(jì)念館成立南京大屠殺史與國際和平研究院，與南京大學(xué)合作建設(shè)和平研究中心以及和平學(xué)學(xué)科。積極支持中英文《世界和平城市》叢書等和平學(xué)著作出版。以國家公祭活動為統(tǒng)攬，運(yùn)用和平主題，積極與國際城市開展交流互鑒，把國際關(guān)注、中國方案、南京實踐和建鄴力量有機(jī)結(jié)合起來，提升城市文化國際影響力。

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Serum-free medium for suspension culture of recombinant Chinese hamster ovary(11G-S)cells

Xingmao Liu, Hong Liu, Lingling Ye, Shichong Li, Benchuan Wu, Haitao Wang, Jing Xie,and Zhaolie Chen
Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received:December 21, 2009;Accepted:May 10, 2010

Supported by:National Major Special Program of New Drug Research and Development(No.2009ZX09503-011).

Corresponding author:Zhaolie Chen.Tel: +86-10-66948818; Fax: +86-10-63841526; E-mail: chenzl23@hotmail.com“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助課題(No.2009ZX09503-011)資助。