張靜，周景文，劉立明，劉杰，陳克杰，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室，無(wú)錫 214122 3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

分階段pH調(diào)控提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)

張靜1,2，周景文1,2，劉立明1,2，劉杰3，陳克杰1,2，堵國(guó)成2，陳堅(jiān)1,2

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室，無(wú)錫 214122 3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

為了提高酮古龍酸菌Ketogulonicigenium vulgare和巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium生產(chǎn) 2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的生產(chǎn)效率，分析了pH對(duì)K.vulgare和B.megaterium生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，發(fā)現(xiàn)K.vulgare和B.megaterium的最適生長(zhǎng)pH值分別為6.0和8.0，但是K.vulgare的糖酸轉(zhuǎn)化活力在pH 7.0時(shí)達(dá)到最大值，因此提出了三階段pH控制策略(第一階段：0～8 h，pH 8.0；第二階段：8～20 h，pH 6.0；第三階段：20 h至發(fā)酵結(jié)束，pH 7.0)以促進(jìn)K.vulgare生長(zhǎng)和2-KLG生產(chǎn)。結(jié)果表明，三階段pH控制策略的實(shí)施進(jìn)一步提高了2-KLG的產(chǎn)量(77.3 g/L)、生產(chǎn)強(qiáng)度(1.38 g/(L·h))和L-山梨糖消耗速率(1.42 g/(L·h))，分別比恒定pH 7.0時(shí)提高了9.7%、33.2%和25.7%。

pH調(diào)控策略，酮古龍酸菌，巨大芽胞桿菌

Abstract:The aim of this study was to improve the 2-keto-L-gulonic acid(2-KLG)production efficiency byKetogulonicigenium vulgareandBacillus megateriumby using multi-stage pH control strategy.The effect of pH on the cell growths and 2-KLG production showed that the optimum pH forK.vulgareandB.megateriumcell growth were 6.0 and 8.0, respectively, while the optimum pH for 2-KLG production was 7.0.Based on the above results, we developed a three-stage pH control strategy: the pH was kept at 8.0 during the first 8 h, then decreased to 6.0 for the following 12 h, and maintained at 7.0 to the end of fermentation.With this strategy, the titer, productivity of 2-KLG and L-sorbose consumption rate were achieved at 77.3 g/L, 1.38 g/(L·h)and 1.42 g/(L·h),respectively, which were 9.7%, 33.2% and 25.7% higher than the corresponding values of the single pH(pH 7.0)control model.

Keywords:pH control strategy,Ketogulonicigenium vulgare,Bacillus megaterium

以酮古龍酸菌Ketogulonicigenium vulgare[1]和巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium為生產(chǎn)菌株，采用 L-山梨糖為底物合成維生素 C前體—2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)是一典型的混菌發(fā)酵體系。其中，K.vulgare是產(chǎn)酸菌，含有轉(zhuǎn)化L-山梨糖為2-KLG的完整酶系，但其單獨(dú)生長(zhǎng)微弱，產(chǎn)酸較少。B.megaterium作為K.vulgare的伴生菌，在形成芽胞的過(guò)程中裂解釋放活性物質(zhì)促進(jìn)K.vulgare生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[2]。我國(guó)科研工作者已在發(fā)酵優(yōu)化[3-13]、兩菌關(guān)系[14]、酶學(xué)性質(zhì)[15-16]等方面開(kāi)展了大量卓有成效的研究工作。然而，制約 2-KLG產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度進(jìn)一步提高的關(guān)鍵在于如何調(diào)控兩菌之間的關(guān)系。盡管有研究表明分子量在30～50 kDa范圍內(nèi)和大于100 kDa的大菌胞外液組分都具有促進(jìn)K.vulgare轉(zhuǎn)化 L-山梨糖生成2-KLG的作用。趙世光等分離純化了一種58 kDa的B.megaterium胞外蛋白，明顯促進(jìn)K.vulgare關(guān)鍵酶L-山梨糖脫氫酶的轉(zhuǎn)化效率[17]。但實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中更希望發(fā)展一種高效、簡(jiǎn)單、易于操作的調(diào)控手段，使B.megaterium適時(shí)地、定向地釋放胞內(nèi)活性物質(zhì)，以促進(jìn)K.vulgare生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。由于K.vulgare和B.megaterium分屬不同的微生物種屬，相應(yīng)的生理需求也不盡相同?；谶@一思路，本研究在透徹研究pH對(duì)K.vulgare和B.megaterium生長(zhǎng)影響的基礎(chǔ)上，導(dǎo)向性地采用分階段pH控制策略，實(shí)現(xiàn)了2-KLG的高效生產(chǎn)。這一針對(duì)混菌發(fā)酵體系中不同菌株提供不同pH需求的發(fā)酵控制策略，有別于以往的單菌發(fā)酵系統(tǒng)的分階段控制策略，為提高混菌發(fā)酵體系的生產(chǎn)效率，提供了新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

K.vulgare和B.megaterium由江蘇江山制藥有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子和斜面培養(yǎng)基(g/L)：L-山梨糖 20，酵母膏3，蛋白胨 10，牛肉膏 3，玉米漿粉1.5，尿素1，碳酸鈣1，硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀1；瓊脂 20(斜面培養(yǎng)基)，定容至 1 L，pH 6.7～7.0，121℃滅菌 15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：L-山梨糖 80，尿素12，碳酸鈣 5，硫酸鎂 0.1，磷酸二氫鉀 1，玉米漿 5，定容至1 L，pH 6.7～7.0，121℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)條件

單獨(dú)K.vulgare培養(yǎng)：將菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中于30℃、200 r/min培養(yǎng)32 h后，按體積濃度10%的接種量接種于裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)72 h，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為1.5 L/min，pH分別控制在5.0、6.0、7.0、8.0。

單獨(dú)B.megaterium培養(yǎng)：將菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中于30℃、200 r/min培養(yǎng)9 h后，按體積濃度10%的接種量接種于裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)72 h，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為 1.5 L/min，pH 分別控制在 5.0、6.0、7.0、8.0。

混菌培養(yǎng)：將K.vulgare和B.megaterium以3∶1的比例接種于種子培養(yǎng)基中于30℃、200 r/min培養(yǎng)18 h后，按體積濃度10%的接種量接種于裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)72 h，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，空氣通氣量為1.5 L/min，pH根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)控制。

1.4 分析方法

2-KLG和L-山梨糖的濃度用HPLC分析。發(fā)酵樣品用流動(dòng)相 10倍稀釋?zhuān)?.45 μm 濾膜過(guò)濾。Agilent 1100 system，BioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱；流動(dòng)相：2.75 μmol/L濃硫酸；柱溫：35℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

細(xì)胞濃度測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)法：取發(fā)酵液經(jīng)適度稀釋?zhuān)稳胙蛴?jì)數(shù)板，在油鏡下分別計(jì)量?jī)删鷶?shù)量。

糖酸轉(zhuǎn)化活力：在10 mL含2% L-山梨糖的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0)中，加入一定量的K.vulgare細(xì)胞，制成終濃度約為1×109CFU/mL的休止細(xì)胞懸液，30℃振蕩培養(yǎng)1 h，立即終止反應(yīng)，用HPLC法測(cè)定2-KLG的生成量。糖酸轉(zhuǎn)化活力定義為：30℃每小時(shí)轉(zhuǎn)化L-山梨糖生成1 mg 2-KLG為一個(gè)糖酸轉(zhuǎn)化活力單位(U)。

2 結(jié)果

2.1 不同pH值對(duì)K.vulgare細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

采用3 mol/L Na2CO3或4 mol/L HCl將發(fā)酵過(guò)程中 pH值分別控制在 5.0、6.0、7.0、8.0以考察pH值對(duì)K.vulgare生長(zhǎng)的影響(圖1)。結(jié)果表明，K.vulgare在pH 6.0時(shí)達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率的時(shí)間(22 h)比pH 5.0、pH 7.0和pH 8.0分別縮短了5 h、2 h、2 h。pH 6.0時(shí)K.vulgare最大比生長(zhǎng)速率為0.098 h?1，比pH 5.0、pH 7.0和pH 8.0時(shí)的最大比生長(zhǎng)速率分別提高了68%、14%和73%。pH為6.0時(shí)K.vulgare細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)末期(細(xì)胞比生長(zhǎng)速率＜0.02)僅用了35 h，與其他pH條件下比較，縮短了4～6 h。這一結(jié)果表明，pH是影響K.vulgare生長(zhǎng)的一個(gè)重要環(huán)境因素，其最適生長(zhǎng)pH為6.0，過(guò)低或過(guò)高pH值均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖1 pH對(duì)K.vulgare生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of pH on theK.vulgaregrowth.curve 1: pH 5.0;curve 2: pH 6.0; curve 3: pH 7.0; curve 4: pH 8.0.

2.2 不同pH值對(duì)B.megaterium細(xì)胞生長(zhǎng)和芽胞形成的影響

不同pH值對(duì)B.megaterium細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖2A所示。隨著發(fā)酵液中 pH不斷增加，B.megaterium最大比生長(zhǎng)速率逐漸增加，pH 8.0時(shí)達(dá)到最大值，為0.74 h?1(4 h)，而pH 5.0時(shí)這一數(shù)值僅為0.29 h?1(12 h)。比生長(zhǎng)速率的提高顯著縮短了細(xì)胞生長(zhǎng)所需時(shí)間，因此，發(fā)酵液中pH為8.0時(shí)，B.megaterium培養(yǎng)僅8 h后就達(dá)到其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期。

B.megaterium在達(dá)到最大細(xì)胞濃度后迅速自溶或形成芽胞，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量劇減(圖2A)。在所研究的pH(pH 5.0～8.0)范圍內(nèi)，B.megaterium衰亡速率隨著發(fā)酵液中pH的增加而逐漸降低，pH 8.0時(shí)細(xì)胞衰亡速率(0.10 h?1)為 pH 5.0(0.29 h?1)時(shí)的 36%(圖2A)。

圖2 pH對(duì)B.megaterium(A)和 B.megaterium芽胞(B)生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH on theB.megateriumgrowth(A)and the sporulation (B).curve 1: pH 5.0; curve 2: pH 6.0; curve 3:pH 7.0; curve 4: pH 8.0.

圖2B表明pH 7.0時(shí)B.megaterium達(dá)到最大芽胞比形成速率的時(shí)間僅為10 h(0.32 h?1)。另一方面，最大芽胞數(shù)量與其最大細(xì)胞濃度的比值隨著發(fā)酵液中pH的增加而增加，如pH 5.0時(shí)為3%，而pH 8.0時(shí)則升至21%。上述闡述表明，酸性pH值明顯抑制了B.megaterium芽胞形成率。在利用混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的過(guò)程中，K.vulgare需要B.megaterium提供其賴(lài)以生長(zhǎng)和合成 2-KLG的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。若B.megaterium裂解后形成大量的芽胞，則不利于K.vulgare生長(zhǎng)和2-KLG生產(chǎn)。這是因?yàn)锽.megaterium在形成芽胞過(guò)程中，部分胞內(nèi)活性物質(zhì)殘存于芽胞中，導(dǎo)致其釋放的胞內(nèi)活性物質(zhì)減少。因此，為了進(jìn)一步提高2-KLG的生產(chǎn)效率，宜將芽胞形成階段的pH值控制為酸性。

2.3 pH對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化能力的影響

2-KLG的合成途徑主要涉及K.vulgare的3個(gè)關(guān)鍵酶：L-山梨糖脫氫酶、L-山梨酮脫氫酶和2-KLG還原酶。然而，上述三者的最適 pH值相差較大，其中L-山梨糖脫氫酶的最適pH值為6.86[18]，L-山梨酮脫氫酶的最適pH值大于9.0，2-KLG還原酶的最適pH為6.5[19]。其中L-山梨糖脫氫酶可以直接轉(zhuǎn)化L-山梨糖為2-KLG，是維生素C二步發(fā)酵的關(guān)鍵酶，而2-KLG還原酶可以催化 2-KLG還原為L(zhǎng)-艾杜糖酸。靜息細(xì)胞體系中 pH值對(duì)K.vulgare糖酸轉(zhuǎn)化活力的影響如圖3所示，pH 7.0時(shí)，K.vulgare細(xì)胞的糖酸轉(zhuǎn)化能力達(dá)到最大。而酸性環(huán)境(pH＜7.0)或者堿性環(huán)境(pH＞7.0)均使糖酸轉(zhuǎn)化能力受到一定程度的抑制。

2.4 分階段pH控制策略促進(jìn)2-KLG生產(chǎn)

綜合圖1～3，可得出如下結(jié)論：1)B.megaterium最適生長(zhǎng)pH是8.0；2) 最佳B.megaterium裂解和最低芽胞生成率的pH為6.0以下；3)K.vulgare最適生長(zhǎng) pH是 6.0；4)合成 2-KLG的最佳 pH為7.0。上述結(jié)論表明，2-KLG發(fā)酵過(guò)程始終將pH控制為 7.0的發(fā)酵控制策略顯然不能高效地發(fā)揮微生物細(xì)胞的生理功能，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程效率降低，而生產(chǎn)成本顯著提高。因此，需要在綜合考慮下述 3點(diǎn)因素：1)發(fā)酵初期使B.megaterium迅速生長(zhǎng)并于對(duì)數(shù)末期后迅速裂解，釋放大量胞內(nèi)活性物質(zhì)；2)K.vulgare快速生長(zhǎng)至最大細(xì)胞濃度；3)進(jìn)一步產(chǎn)酸階段時(shí)2-KLG合成能力的基礎(chǔ)上，發(fā)展最適的pH控制策略：發(fā)酵初期(0～8 h)控制pH為8.0以促進(jìn)B.megaterium生長(zhǎng)；發(fā)酵中期(8～20 h)控制pH為6.0促進(jìn)B.megaterium裂解，降低芽胞形成率和縮短K.vulgare生長(zhǎng)延滯期；發(fā)酵后期(20 h至發(fā)酵結(jié)束)控制pH為7.0以提升2-KLG的合成能力，從而提高2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度(圖4)。采用這一分階段pH值調(diào)控策略，顯著提高了2-KLG的合成能力和底物L(fēng)-山梨糖的消耗能力。使2-KLG產(chǎn)量(77.3 g/L)、生產(chǎn)強(qiáng)度(1.38 g/(L·h))和 L-山梨糖消耗速率(1.42 g/(L·h))比單一 pH值(7.0)控制模式下相應(yīng)數(shù)據(jù)分別提高了9.7%、33.2%和25.7%(表1)。然而，這一 pH控制策略并不能顯著提高 L-山梨糖消耗的總量及其轉(zhuǎn)化為2-KLG的轉(zhuǎn)化率。

圖3 pH對(duì)K.vulgare糖酸轉(zhuǎn)化活力的影響Fig.3 Effect of pH on conversion ability ofK.vulgare.

表1 分階段控制策略與恒定pH發(fā)酵的特征發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Fermentation properties of 2-KLG fermentation in constant pH 7.0 and in pH control by stages

圖4 不同pH控制策略對(duì)2-KLG發(fā)酵的影響Fig.4 Comparison of time courses between three-staged pH strategy(T)and constant pH strategy(C).(A)B.megaterium.(B)K.vulgare.(C)2-KLG.(D)L-sorbose consumption.

3 結(jié)論

本文在詳盡分析2-KLG發(fā)酵過(guò)程中pH如何影響B(tài).megaterium和K.vulgare生長(zhǎng)及2-KLG合成的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高 2-KLG生產(chǎn)效率，針對(duì)性地提出0～8 h控制pH為8.0，8～20 h控制pH為6.0，發(fā)酵20 h后切換至7.0的pH分階段控制策略，使 2-KLG的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和 L-山梨糖消耗速率比控制pH為7.0模式下分別提高了9.7%、33.2%和25.7%。

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Enhancement of 2-keto-L-gulonic acid production using three-stage pH control strategy

Jing Zhang1,2, Jingwen Zhou1,2, Liming Liu1,2, Jie Liu3, Kejie Chen1,2, Guocheng Du2,and Jian Chen1,2
1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2 Biological Systems and Bio-processing Laboratory, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 3 Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co., Ltd., Jingjiang 214500, China

Received:January 29, 2010;Accepted:April 27, 2010

Supported by:National Science Fund for Distinguished Young Scholars(No.20625619), National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(No.2007CB 714306), Innovative Research Team for University of Jiangsu Province, National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA020303), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(No.2007BAI46B02).

Corresponding author:Jian Chen.Tel: +86-510-85918309; E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn Liming Liu.Tel: +86-510-85918307; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn國(guó)家杰出青年基金(No.20625619)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2007CB 714306)，江蘇高等學(xué)校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2006AA020303)，“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2007BAI46B02)資助。