黃秀梅，姜岷，李建，鄭曉宇，楊卓娜，方曉江，葉貴子

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

外源添加代謝中間體對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響

黃秀梅，姜岷，李建，鄭曉宇，楊卓娜，方曉江，葉貴子

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

考察了外源添加中間代謝產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，結(jié)果表明添加 0.5 g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)時(shí)丁二酸產(chǎn)量最高。圍繞產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行代謝通量分析，發(fā)現(xiàn)添加PEP后己糖磷酸途徑(HMP)與糖酵解途徑(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6，解決了丁二酸合成過(guò)程中還原力不足的矛盾，導(dǎo)致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%，丁二酸代謝通量從99.8 mmol/(g DCW·h)增至124.4 mmol/(g DCW·h)，而副產(chǎn)物乙酸及甲酸的代謝通量分別降低了22.9%、15.4%；關(guān)鍵酶活分析結(jié)果表明，添加0.5 g/L PEP后PEP羧化激酶比酶活達(dá)到1910 U/mg，與對(duì)照相比提高了74.7%，而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最終丁二酸濃度為29.1 g/L，收率達(dá)到76.2%，比未添加PEP時(shí)提高了11.0%。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，丁二酸，代謝通量分析，中間代謝產(chǎn)物，酶活

Abstract:We investigated the effect of adding intermediate metabolites on cell growth and succinate production.The yield of succinic acid achieved to the highest when 0.5 g/L phosphoenolpyruvic acid(PEP)was added.According to the metabolic network ofActinobaccilus succinogenesNJ113, the metabolic flux was calculated by metabolic flux analysis.The ratio of hexose monophosphate pathway to glycolytic pathway increased from 39.4:60.3 to 76.8:22.6 after adding 0.5 g/L PEP, thus the reducing power was better balanced.The flux of PEP to oxaloacetate was 23.8% higher, which made the succinic acid flux improve from 99.8 mmol/(g DCW·h)to 124.4 mmol/(g DCW·h)and the flux of acetic acid and formic acid decreased by 22.9% and 15.4%,respectively.The key enzyme activity analysis showed that the specific activity of PEP carboxykinase reached to 1910 U/mg with 0.5 g/L PEP addition, which was 74.7% higher than the control; and the specific activity of pyruvate kinase decreased by 67.5%.Finally, the concentration of succinic acid was 29.1 g/L with the yield of 76.2%.

Keywords:Actinobaccilus succinogenes, succinic acid, metabolic flux analysis, intermediate metabolite, enzyme activity

丁二酸(又名琥珀酸)作為T(mén)CA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物以及厭氧代謝的終端還原產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物中[1-2]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是石化法，其污染大、成本高，嚴(yán)重抑制了丁二酸作為大宗化學(xué)品的發(fā)展?jié)摿?。隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展和成熟，生物法生產(chǎn)丁二酸由于其高效率、環(huán)保性以及原料的可再生性而引起許多研究者的注意[3-4]。

近年來(lái)，基于途徑分析及代謝流分析的調(diào)控手段非常普遍[5]。潘軍華等[6]通過(guò)添加醋酸鹽、生物素、泛酸鹽等對(duì) FP094菌株中由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、丙酮酸(PYR)和草酰乙酸(OAA)構(gòu)成的“三角區(qū)”進(jìn)行擾動(dòng)，定性分析了此擾動(dòng)對(duì)賴(lài)氨酸合成所需前提物代謝流量的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而提高賴(lài)氨酸的產(chǎn)量。王帥等[7]在谷氨酸發(fā)酵研究中，發(fā)現(xiàn)添加少量乳酸會(huì)促進(jìn)丙酮酸含量的增加，而丙酮酸是谷氨酸的前提物質(zhì)，最終谷氨酸產(chǎn)量提高15%。劉立明等[8]研究了添加TCA循環(huán)中間產(chǎn)物可以促進(jìn)光滑球擬酵母CCTCC M202019生長(zhǎng)及積累丙酮酸的影響，得出OAA更能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，丙酮酸得率及生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高6%和24%。

生物法制備丁二酸的過(guò)程主要是將 EMP途徑中得到的PEP經(jīng)由TCA循環(huán)的還原支路，通過(guò)一步CO2固定和兩步還原反應(yīng)生成丁二酸。該過(guò)程涉及的關(guān)鍵酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、富馬酸酶和富馬酸還原酶。McKinlay等[9]利用13C原子標(biāo)記分析代謝中間產(chǎn)物中的同位素位置研究丁二酸的代謝途徑，結(jié)果表明PEP是代謝過(guò)程中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，它將整個(gè)代謝流分配到兩個(gè)支路：一部分PEP生成OAA，繼而生成丁二酸，稱(chēng)作 C4支路；另一部分 PEP生成 PYR，進(jìn)而生成乙酸、甲酸等副產(chǎn)物，稱(chēng)作C3支路。同時(shí)，草酰乙酸和蘋(píng)果酸(MAL)可經(jīng)脫羧反應(yīng)生成丙酮酸，使代謝流在 C4和 C3支路間進(jìn)行重新分配。因此，除PEP外，OAA、MAL和PYR也是代謝流分配中的重要節(jié)點(diǎn)。

目前，通過(guò)添加少量代謝中間體對(duì)丁二酸代謝途徑進(jìn)行擾動(dòng)的研究在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要從代謝通量分析角度，考察添加少量代謝中間產(chǎn)物(如PEP、PYR等)對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113代謝通量分布及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的影響，并結(jié)合關(guān)鍵酶酶活分析說(shuō)明其影響機(jī)理，為優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesNJ113由本實(shí)驗(yàn)室自主篩選并保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10(分消)，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4·3H2O 15.5，pH 7.0，121℃滅菌 15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40(分消)，酵母膏10，玉米漿 10，乙酸鈉 1.36，KH2PO43，MgCl2·6H2O 0.2，CaCl20.2，NaCl 1，Na2HPO4·12H2O 0.31，NaH2PO4·2H2O 1.6，pH 7.0，121℃滅菌 15 min(搖瓶培養(yǎng)需加20 g/L碳酸鎂)。

1.3 培養(yǎng)方法

種子采用100 mL血清瓶培養(yǎng)，裝液量50 mL，接種量 2%(種子是相同條件下活化后的培養(yǎng)物)，于37℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)11 h；血清瓶發(fā)酵培養(yǎng)裝液量 30 mL，接種量 3%，通無(wú)菌 100% CO2直至pH 6.8～7.0，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，在37℃下培養(yǎng) 20 h；3 L 發(fā)酵罐(BioFlo 110 fermenter，NBS)裝液量1.5 L，接種量7%，300 g/L Na2CO3控制過(guò)程pH 6.8，于 37℃、攪拌轉(zhuǎn)速 200 r/min、100% CO2(通氣量0.5 L/min)條件下培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)胞干重測(cè)定

稱(chēng)出干燥10 mL離心管重量(G1)，取4 mL發(fā)酵液置于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清液；再用4 mL蒸餾水清洗2次，離心，于60℃烘箱中干燥至恒重后稱(chēng)重(G2)，則菌體干重(g/L)=(G2?G1)/4。

1.4.2 葡萄糖、乙醇及有機(jī)酸的測(cè)定

采用高效液相色譜法(戴安 Ultimate 3000系列)，色譜柱為Aminex? HPX-87H型離子排斥色譜柱(300 mm×7.8 mm id，5 μm)，以 0.005 mol/L H2SO4水溶液作為流動(dòng)相，流速 0.6 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫55℃，葡萄糖和乙醇利用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，丁二酸、乙酸、甲酸等利用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，波長(zhǎng)為215 nm。

1.4.3 酶活的測(cè)定

細(xì)胞抽提物的制備：取30 mL穩(wěn)定期的發(fā)酵液于50 mL離心管中，10 000 r/min、4℃離心10 min，棄去上清液，用5 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0，含有 100 mmol/L Tris，20 mmol/L KCl，5 mmol/L MnSO4，2 mmol/L DTT，100 mmol/L EDTA)溶液洗滌2次后將細(xì)胞懸浮，置于冰槽中超聲破碎20 min；結(jié)束后10 000 r/min、4℃離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，保存在?80℃冰箱待用。

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：Bradford法[10]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

PEP羧化激酶(Pepck)酶活測(cè)定[11]體系：300 mmol/L Tris-HCl(pH 6.6)，300 mmol/L MgCl2，150 mmol/L MnCl2，1.125 mol/L NaHCO3，12 U/mL蘋(píng)果酸脫氫酶，100 mmol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，150 mmol/L PEP，細(xì)胞提取液；所有底物于37℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機(jī)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于340 nm處測(cè)定反應(yīng)的初速度。

丙酮酸激酶(Pyk)酶活測(cè)定體系[12]：300 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，300 mmol/L MgCl2，750 mmol/L KCl， 12 U/mL 乳酸脫氫酶，100 mmol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，150 mmol/L PEP，細(xì)胞提取液；所有底物于37℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機(jī)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于 340 nm處測(cè)定反應(yīng)的初速度。

蘋(píng)果酸脫氫酶(Mdh)酶活測(cè)定體系[11]：400 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，1.2 mmol/L NADH，15 mmol/L OAA，細(xì)胞提取液；所有底物于37℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機(jī)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于340 nm處測(cè)定反應(yīng)的初速度。

酶活單位的定義：一個(gè)酶活力單位(U)定義為1 min催化1 nmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量；比活力為每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)。

式中，ΔA為吸光度隨時(shí)間的變化(min?1)，V為反應(yīng)體系體積(mL)，ε為摩爾消光系數(shù)(NADH在 340 nm 時(shí)為 6.22×103L/(mol·cm))，v為樣品量(mL)，L為比色皿光徑(cm)，109為將 mol換算成nmol。

比活力(U/mg)=酶活力單位/蛋白濃度。

1.4.4 代謝過(guò)程及通量分析

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11]和[13]，發(fā)酵產(chǎn)物以及酶活分析，建立了A.succinogenes以葡萄糖作為碳源合成丁二酸的代謝網(wǎng)絡(luò)，主要包括糖酵解(EMP)、磷酸己糖(HMP)、C3、C4、維持消耗以及生物量的合成途徑。在建立網(wǎng)絡(luò)模型時(shí)做了以下假設(shè)和簡(jiǎn)化處理：1)細(xì)胞中的中間代謝物處于擬穩(wěn)態(tài)，在整個(gè)反應(yīng)中不積累；2)只考慮主要中心碳代謝反應(yīng)的物流平衡；3)忽略培養(yǎng)基中有機(jī)氮源對(duì)細(xì)胞合成通量的貢獻(xiàn)；4)能量供需平衡，即合成菌體與產(chǎn)物所需的能量和EMP、HMP產(chǎn)生的能量總數(shù)相等；5)在代謝過(guò)程中，由于一部分碳源用于細(xì)胞的維持、產(chǎn)能、CO2放出以及分泌其他一些未知的代謝產(chǎn)物等，造成碳源的不平衡現(xiàn)象，在代謝網(wǎng)絡(luò)通量的計(jì)算時(shí)忽略該部分通量；6)A.succinogene細(xì)胞組成參考McKinlay等[9]的研究，單一化為 CH2O0.5N0.2統(tǒng)一處理。整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)包括 24個(gè)代謝反應(yīng)方程，見(jiàn)表 1。

根據(jù)擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)求解通量，即假設(shè)細(xì)胞內(nèi)的中間代謝物濃度變化速率為0，有Ar=X，其中，A為胞內(nèi)代謝反應(yīng)計(jì)量系數(shù)矩陣(n×m)，r為代謝反應(yīng)速率向量(m×1)，X為代謝物凈積累速率向量(n×1)，m與n分別為反應(yīng)方程和代謝中間體的個(gè)數(shù)。整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)包含24個(gè)代謝反應(yīng)，其中中間代謝物為18個(gè)，自由度為6；可測(cè)速率有7個(gè)，即葡萄糖消耗速率以及丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸、乙醇、細(xì)胞的生成速率。根據(jù)中間產(chǎn)物代謝平衡方程(表 2)列出矩陣A。由于可測(cè)定的速率大于自由度，該系統(tǒng)為超定系統(tǒng)，可用最小二乘法求得簡(jiǎn)單解，利用MATLAB軟件線性規(guī)劃求得代謝分布。在代謝通量的計(jì)算中，均以100 mmol/(g DCW·h)的葡萄糖為計(jì)算基準(zhǔn)，所有代謝通量r的單位均為mmol/(g DCW·h)。

表1 代謝反應(yīng)方程Table 1 Metabolic reactions

2 結(jié)果與討論

2.1 外源添加中間代謝產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵的影響

外源添加少量的代謝中間體可能對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵酶活產(chǎn)生影響，從而影響代謝產(chǎn)物的分布情況。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清瓶發(fā)酵考察不同濃度的PEP、PYR、OAA及MAL對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，這4種物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度范圍為0～2 g/L，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 代謝通量方程Table 2 Equations of metabolic flux

表3 添加中間代謝產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵的影響Table 3 Effects of adding intermediate metabolite on succinate fermentation

由表3可知，外源添加各種中間代謝對(duì)菌體濃度及丁二酸產(chǎn)量都有一定的影響。添加少量 PEP、OAA以及MAL對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸均有一定的促進(jìn)作用，其中添加PEP的效果最好。當(dāng)培養(yǎng)基中PEP濃度為 0.5 g/L時(shí)菌體濃度及丁二酸產(chǎn)量都達(dá)到最大，丁二酸收率達(dá)到83.2%，較對(duì)照提高9.3%；而繼續(xù)增加 PEP濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及丁二酸產(chǎn)量影響不明顯，甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，培養(yǎng)基中PEP的最佳添加濃度為0.5 g/L，以下實(shí)驗(yàn)主要考察添加0.5 g/L PEP對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。

2.2 外源添加PEP對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在3 L發(fā)酵罐中考察添加0.5 g/L PEP對(duì)NJ113厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 不添加PEP的發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.1 Process of succinic acid fermentation without addition of PEP.

圖2 添加0.5 g/L PEP的發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Process of succinate fermentation with 0.5 g/L PEP added.

從圖1、圖2可以看出，添加PEP后整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的變化趨勢(shì)與對(duì)照(不添加 PEP的發(fā)酵過(guò)程)一致。菌體在2～8 h內(nèi)生長(zhǎng)最快，8 h時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到最大，雖然較對(duì)照的略低，但其穩(wěn)定期較長(zhǎng)，衰亡速率較慢，最終丁二酸產(chǎn)量并沒(méi)有下降，丁二酸濃度為29.1 g/L，收率達(dá)到76.2%，比未添加PEP時(shí)的 65.2%提高了 11.0%。副產(chǎn)物乙酸、甲酸的濃度與對(duì)照相比均有所降低。PEP作為A.succinogenesNJ113代謝途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，少量PEP的加入可能擾亂了菌體的正常代謝，提高或降低了某些關(guān)鍵酶活，從而改變代謝產(chǎn)物的分布，最終導(dǎo)致丁二酸產(chǎn)量的提高。雖然添加PEP后發(fā)酵罐培養(yǎng)的丁二酸濃度較對(duì)照提高了，但是遠(yuǎn)低于搖瓶培養(yǎng)的水平，原因可能是發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中流加的 Na2CO3溶液對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)生了稀釋作用，從而導(dǎo)致罐子的丁二酸濃度較搖瓶的低。

2.3 外源添加PEP對(duì)代謝通量分布的影響

代謝通量可以直觀地反映不同途徑的相互作用以及圍繞代謝分支點(diǎn)的物質(zhì)流分布，進(jìn)而表征細(xì)胞的代謝能力[14]。為探討外源添加PEP的影響機(jī)理，對(duì)A.succinogenesNJ113進(jìn)行代謝通量分析。利用菌體細(xì)胞穩(wěn)定且碳代謝流旺盛時(shí)(即穩(wěn)定期)的培養(yǎng)檢測(cè)參數(shù)作為代謝通量常數(shù)項(xiàng)，因此選擇10 h、10.5 h、11 h、11.5 h、12 h取樣分析發(fā)酵液中的菌體、葡萄糖、丁二酸、乙酸及甲酸的濃度，得到在11 h時(shí)的單位時(shí)間濃度變化率，并計(jì)算得到各反應(yīng)(r1～rBM)的代謝通量。PEP添加與否的代謝通量分布情況如圖3所示。

從圖3中的通量分布情況可以看出，在發(fā)酵后期(11 h)消耗很少的碳源用于菌體的合成，添加0.5 g/L PEP的細(xì)胞合成通量與對(duì)照相比變化不大，底物葡萄糖主要用來(lái)合成產(chǎn)物丁二酸等。通量變化主要在通往HMP途徑、C3及C4途徑的摩爾通量上，其中PEP是影響丁二酸合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，PYR是影響乙酸、甲酸等副產(chǎn)物生成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。添加PEP后流向C4途徑的通量r13比對(duì)照提高了23.8%，丁二酸代謝通量從 99.8 mmol/(g DCW·h)增至124.4 mmol/(g DCW·h)；同時(shí)，流向C3途徑的通量r6有所降低，導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸及甲酸的代謝通量分別降低了 22.9%、15.4%，使得更多的碳源用于合成產(chǎn)物丁二酸，最終提高了丁二酸產(chǎn)量。

圖3 添加PEP對(duì)代謝通量分布的影響(左邊：不添加PEP；右邊：添加PEP)Fig.3 Effects of adding PEP on metabolic flux distribution.Left flux from the control, right flux from the results of adding PEP.

2.4 外源添加PEP對(duì)關(guān)鍵酶活的影響

細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中的每一個(gè)反應(yīng)都是由某種特定的酶催化的，酶活力的大小可以直接反映各個(gè)反應(yīng)的速率。外界環(huán)境(如pH、溫度等)的改變都會(huì)對(duì)酶活力產(chǎn)生不同程度的影響，從而影響代謝產(chǎn)物的分布情況。A.succinogenesNJ113代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)是PEP及PYR[9]，PEP在Pepck作用下生成OAA進(jìn)入C4途徑，之后OAA在Mdh作用下生成蘋(píng)果酸，最終生成目標(biāo)產(chǎn)物丁二酸；而PEP也可以在Pyk作用下生成丙酮酸進(jìn)入C3途徑，生成副產(chǎn)物乙酸、甲酸等。實(shí)驗(yàn)測(cè)定穩(wěn)定期時(shí)(11 h)添加PEP后發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵酶活，并與對(duì)照比較，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，關(guān)鍵酶Pepck的比活力變化非常明顯，添加0.5 g/L PEP后Pepck比酶活達(dá)到1 910 U/mg，比對(duì)照提高了74.7%；同時(shí)Mdh也有所提高。而Pyk的比酶活有所降低，添加0.5 g/L PEP后Pyk為160 U/mg，與不添加PEP相比降低了67.5%。因此，Pepck酶活的提高使得進(jìn)入C4途徑的碳流量增加，從而減少進(jìn)入C3途徑的碳流量，這與Pyk酶活降低是一致的，最終合成更多的丁二酸，同時(shí)降低乙酸及甲酸的產(chǎn)量。

圖4 添加PEP對(duì)關(guān)鍵酶活的影響Fig.4 Effects of PEP added on the key enzyme activity.

2.5 外源添加PEP對(duì)還原力通量分布的影響

在A.succinogenesNJ113厭氧代謝途徑中，1 mol葡萄糖可以生成2 mol PEP以及2 mol NADH，而2 mol PEP生成2 mol丁二酸時(shí)需要消耗4 mol NADH，副產(chǎn)物乙酸、甲酸的形成過(guò)程不消耗也不產(chǎn)生 NADH，可見(jiàn)，產(chǎn)物丁二酸合成的矛盾是還原力不足，積累更多的NADH將有利于丁二酸的合成。代謝通量分析結(jié)果表明添加0.5 g/L PEP后HMP途徑與EMP途徑的通量比由對(duì)照的39.4∶60.3提高至76.8∶22.6，也就是說(shuō)，通量更多地從G6P通過(guò)HMP途徑進(jìn)行代謝，并大量合成NADPH，NADPH除一部分用于細(xì)胞合成外，剩下的可在轉(zhuǎn)氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為NADH[15]用于丁二酸合成，解決了NADH不足的矛盾。代謝網(wǎng)絡(luò)中還原力[H]產(chǎn)生途徑的通量分配情況見(jiàn)表4。

從表4可以看出，NADH產(chǎn)生途徑主要有兩條，即GAP到PEP(r5)和PYR到ACA(r7)，添加PEP對(duì)NADH的通量沒(méi)有明顯的影響，但是NADPH的通量變化(r17)比較明顯，與對(duì)照相比提高了97.5%，導(dǎo)致還原力[H]總通量增加。由于兩種情況下的菌體濃度沒(méi)有明顯的變化，因此，添加PEP條件下有較多的NADPH可在轉(zhuǎn)氫酶的作用下生成NADH，從而用于丁二酸的合成，最終提高丁二酸/(乙酸+甲酸)的比例。

3 結(jié)論

外源添加代謝中間體對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)丁二酸均有一定的影響，其中添加0.5 g/L PEP的效果最好。應(yīng)用代謝通量分析方法得出添加0.5 g/L PEP后HMP與 EMP途徑的通量比由 39.4∶60.3提高至76.8∶22.6，因此可以合成更多的 NADPH，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為NADH，解決了還原力不足的矛盾，導(dǎo)致PEP生成OAA的通量提高了23.8%，丁二酸代謝通量從99.8 mmol/(g DCW·h)增至 124.4 mmol/(g DCW·h)。最終丁二酸濃度為29.1 g/L，收率達(dá)到76.2%，比未添加PEP時(shí)提高了11.0%，同時(shí)副產(chǎn)物乙酸、甲酸等與對(duì)照相比均有所降低。關(guān)鍵酶活分析結(jié)果表明，添加0.5 g/L PEP后可顯著提高Pepck的比活力，PEP比酶活達(dá)到1 910 U/mg，與對(duì)照相比提高了74.7%；同時(shí) Mdh也有所提高。而 Pyk的比酶活有所降低，添加PEP后Pyk為160 U/mg，較對(duì)照降低了67.5%。這與丁二酸產(chǎn)量增加、副產(chǎn)物產(chǎn)量減少是一致的。

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Xiumei Huang, Min Jiang, Jian Li, Xiaoyu Zheng, Zhuona Yang, Xiaojiang Fang, and Guizi Ye
State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, College of Life Science and Pharmacy, Nanjing University of Technology,Nanjing 210009, China

Received:November 13, 2009;Accepted:February 23, 2010

Supported by:National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(No.2009CB724701), National Natural Science Foundation of China(No.20606017), Foundation of State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province, “The Six Talent Summit” of Jiangsu Province(No.06-A-047).

Corresponding author:Min Jiang.Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2009CB724701)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20606017)，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金，江蘇省“青藍(lán)工程”，江蘇省“六大人才高峰”(No.06-A-047)資助。