李鑫，劉軍，趙沁沁，徐愛才

武漢工業(yè)學院生物與制藥工程學院，武漢 430023

共表達SHMT和TPase載體的構建及雙酶法合成L-色氨酸

李鑫，劉軍，趙沁沁，徐愛才

武漢工業(yè)學院生物與制藥工程學院，武漢 430023

利用重組大腸桿菌表達絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)和色氨酸酶(TPase)，并利用雙酶法合成 L-色氨酸。采用 PCR從大腸桿菌 K12基因組中擴增上述兩種酶的基因，利用 pET-28a載體，構建單表達重組質粒 pET-SHMT、pET-TPase和共表達重組質粒pET-ST。將上述3種重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)進行表達。SDS-PAGE結果表明，單表達基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和BL21(DE3)/pET-TPase分別在47 kDa(SHMT)和50 kDa(TPase)處有蛋白表達帶；共表達基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST在上述兩處均有蛋白表達帶。與宿主菌相比，單表達SHMT基因工程菌產酶活性提高了6.4倍；單表達TPase基因工程菌產酶活性提高了8.4倍；共表達SHMT和TPase基因工程菌產酶活性分別提高了6.1和6.9倍。利用工程菌所產酶進行雙菌雙酶法和單菌雙酶法合成L-色氨酸。兩菌雙酶合成L-色氨酸的累積量達到41.5 g/L，甘氨酸轉化率為83.3%，吲哚轉化率為92.5%；單菌雙酶合成L-色氨酸的累積量達到28.9 g/L，甘氨酸轉化率為82.7%，吲哚轉化率為82.9%。

絲氨酸羥甲基轉移酶，色氨酸酶，串聯表達，雙酶法合成

Abstract:Hydroxymethyltransferase(SHMT)and tryptophanase(TPase)are key enzymes in biosynthesis of L-tryptophan.We constructed three recombinant plasmids, including pET-SHMT, pET-TPase, and pET-ST for over-expression or co-expression of SHMT and TPase inEscherichia coliBL21(DE3).The SDS-PAGE analysis showed that the recombinant proteins of 47 kDa and 50 kDa were expressed of pET-SHMT and pET-TPase, respectively.As compared to the host stain, the enzyme activity of SHMT and TPase was increased by 6.4 and 8.4 folds, respectively.Co-expression of both recombinant proteins, 47 kDa and 50 kDa, was also successful by using pET-ST and the enzyme activities were enhanced by 6.1 and 6.9 folds.We designed two pathways of dual-enzymatic synthesis of L-tryptophan by using these recombinant strains as source of SHMT and TPase.In the first pathway, the pET-SHMT carrying strain was used to catalyze synthesis of L-serine, which was further transformed into L-tryptophan by the pET-TPase expressing strain.These two steps sequentially took place in different bioreactors.In the second pathway, the pET-STcarrying strain, in which two enzymes were co-expressed, was used to catalyze simultaneously two steps in a single bioreactor.HPLC analysis indicated a high yield of 41.5 g/L of L-tryptophan was achieved in the first pathway, while a lower yield of 28.9 g/L was observed in the second pathway.In the first pathway, the calculated conversion rates for L-glycine and indole were 83.3% and 92.5%, respectively.In the second pathway, a comparable conversion rate, 82.7%, was achieved for L-glycine, while conversion of indole was much lower, only 82.9%.

Keywords:hydroxymethyltransferase, tryptophanase, co-expression, dual-enzymatic synthesis

L-色氨酸是人和動物重要的必需氨基酸，在醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等方面具有廣泛的用途。它是我國目前尚未實現工業(yè)化生產的少數幾種氨基酸之一，每年需要大量進口。L-色氨酸生產方法有提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉化法。其中，前 3種方法存在材料來源有限、需多步合成工藝和光學拆分以及得率低、周期長等缺點，而酶促轉化法具有終產物積累量高、反應周期短、分離提純容易等優(yōu)點，是廉價生產L-色氨酸有效的方法[1-2]。以L-絲氨酸和吲哚為原料的酶法途徑，是酶法生產L-色氨酸的一條重要途徑[3]，其主要缺陷是 L-絲氨酸價格貴，與L-色氨酸價格幾乎相當。若能以廉價的原料生產絲氨酸，再以所得到的絲氨酸為原料生產 L-色氨酸，則可望實現 L-色氨酸的廉價生產。Hatakeyama等[4]報道了兩步酶法合成L-色氨酸：以價廉的甘氨酸和甲醛為原料，在絲氨酸羥甲基轉移酶的作用下，將甘氨酸和甲醛轉化為L-絲氨酸；再在色氨酸酶的作用下，添加吲哚，則L-絲氨酸可轉變?yōu)?L-色氨酸。在國內，韋平和等[5]也提出了兩步酶法合成L-色氨酸。但Hatakeyama等所用的酶來自兩種微生物細胞，增加了生產工藝的復雜性和成本。迄今未見單一細胞同時生產絲氨酸羥甲基轉移酶和色氨酸酶，并用于酶法生產L-色氨酸的報道。

本研究構建單表達SHMT基因工程菌、單表達TPase基因工程菌、共表達SHMT和TPase基因工程菌。利用構建的3種基因工程菌株，進行兩菌兩次發(fā)酵產酶和單菌一次發(fā)酵產酶。采用雙菌雙酶法和單菌雙酶法兩種途徑完成酶法合成L-色氨酸，對兩種酶法合成途徑進行比較，以期達到簡化產酶菌的發(fā)酵和酶促轉化工藝，降低L-色氨酸生產成本，為實現L-色氨酸的工業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株

pET-28a表達載體、大腸桿菌 K12、大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存。

1.1.2 生化試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶及PyrobestTMDNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒小量提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；丙烯酰胺(Acr)及甲叉雙丙烯酰胺(Bis)購自 Fluka公司；四甲基乙二胺(TEMED)及磷酸吡哆醛(PLP)購自Sigma公司；四氫葉酸為本實驗室自制(硼氫化鈉還原法[6])；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫 1200 HPLC)；泵(安捷倫 1100/1200四元泵)；檢測器(安捷倫1200可變波長檢測器)。

1.2 方法

1.2.1 基因的PCR擴增

PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

PCR 反應體系(50 μL)：無菌三蒸水 40 μL，10×Buffer 5 μL，上、下游引物各 1 μL，模板 1 μL，dNTPs 1 μL，PyrobestDNA 聚合酶 1 μL。兩基因 PCR 反應條件均為：94℃預變性5 min；94 ℃ 1 min ，53℃1 min，72 ℃ 2 min ，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 表達載體的構建

將PCR擴增到的編碼SHMT和TPase的基因分別連接到 pET-28a載體上，構建單表達重組質粒pET-SHMT和pET-Tpase，再利用以上兩個重組質粒構建共表達重組質粒pET-ST。PCR產物純化和凝膠回收按試劑盒說明書進行操作，基因的酶切和連接按所用酶的商品說明書進行操作。

1.2.3 重組工程菌的誘導及酶活測定

將重組質粒轉入大腸桿菌 BL21(DE3)，構建基因工程菌。利用重組菌進行發(fā)酵產酶(方法參照pET操作手冊)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白表達情況[7]，并對重組工程菌所產酶進行酶活測定(SHMT和 TPase酶活測定方法參照文獻[8]和[9])。

1.2.4 雙菌雙酶法合成L-色氨酸

酶促反應以0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0)作為溶劑，反應在500 mL四頸燒瓶中進行，反應液體積為350 mL，其中加入30 g經0.1%(W/V)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解液處理過的產SHMT的菌體，30 g甘氨酸，10 mg PLP，0.5 g四氫葉酸，同時向反應液中加入適量巰基乙醇，并通氮氣以免輔酶四氫葉酸被氧化[10-11]。反應溫度37℃，初始pH為7.5，攪拌速度60 r/min。另一底物甲醛初始加入的濃度控制在20 mmol/L以下，此后以流加的方式加入甲醛，維持反應液pH控制在 6.8～7.2。當反應液pH不變化時，反應達到平衡，停止反應。離心棄菌體，將上述反應液裝入另一反應罐，并向其中加入30 g經同樣方法破碎處理的產TPase的菌體，9 g吲哚，5 mg PLP，200 μL TritonX-100，反應pH調節(jié)到8.8，反應溫度37℃，攪拌速度60 r/min[5]。反應進行時每隔 6 h檢測一次反應液中吲哚濃度(采用對二甲氨基苯甲醛作為顯色劑，進行光度定量測定[12])，當吲哚濃度不再變化時停止反應。

1.2.5 單菌雙酶法合成L-色氨酸

參考雙菌雙酶法反應條件，將經破碎處理的產雙酶的菌體、甘氨酸、吲哚、PLP等原料一次性加入同一反應罐。為使主要反應底物甘氨酸和吲哚能被充分利用，并得到一定累積量的L-色氨酸，實驗設計 3組甘氨酸和吲哚加入量，分別為甘氨酸+吲哚：① 20 g+5 g；② 25 g+7 g；③ 30 g+9 g，輔酶等其余原料的量同比例增減。反應體積仍為350 mL。整個反應過程中通氮氣，反應溫度 37℃，初始 pH為7.5，攪拌速度60 r/min，同樣以流加的方式加入甲醛維持反應液 pH控制在 6.8～7.2。當反應液 pH不再變化以后，每隔2 h檢測反應液中吲哚濃度。當反應液中吲哚濃度不再變化時，終止反應。

1.2.6 高效液相測定L-色氨酸含量

采用安捷倫1200系列安捷倫 C-18反相硅膠柱(5 μm；4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇∶1%冰乙酸= 10∶90；柱流量：1 mL/min；柱溫：30℃；可變波長掃描紫外檢測器(VWD)，檢測波長為280 nm[3]。

2 結果

2.1 重組質粒pET-SHMT和pET-TPase的構建

提取大腸桿菌K12基因組，PCR分別擴增編碼SHMT的基因和TPase的基因，結果見圖1。

圖1 PCR擴增編碼SHMT和TPase的基因Fig.1 Amplification of gene coding SHMT and gene coding TPase by PCR.M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of gene coding SHMT; 2: PCR product of gene coding TPase.

擴增產物與預計大小相符?；厥誔CR產物，經NcoI和BamH I雙酶切，分別連接到經同樣雙酶切的 pET-28a上，構建兩個重組質粒 pET-SHMT和pET-TPase，重組質粒構建過程見圖2。用BglII/Hind III雙酶切鑒定兩個重組質粒，酶切結果見圖3。酶切產生兩條帶，分子量大的與經酶切后的pET-28a條帶大小一致；分子量小的為含有T7啟動子和相應基因的DNA片段，較各自基因的PCR產物分子量大。經酶切鑒定的重組質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果與報道的序列(GenBank Accession No.NC_000913)一致。

2.2 SHMT和TPase共表達重組質粒pET-ST的構建

將已構建的質粒pET-TPase經BglII和Hind III雙酶切，并回收含T7啟動子和TPase基因的DNA片段。用BamH I和Hind III雙酶切質粒pET-SHMT，回收酶切質粒，并與含 T7啟動子和 TPase基因的DNA片段相連，構建共表達重組質粒 pET-ST，共表達重組質粒構建過程見圖2。

圖2 pET-SHMT、pET-TPase和 pET-ST重組質粒的構建Fig.2 Construction of recombinant plasmids pET-SHMT,pET-TPase and pET-ST.

共表達質粒上SHMT和TPase的表達由各自的T7啟動子控制。用BglII和Hind III雙酶切鑒定重組質粒pET-ST，雙酶切結果見圖3，酶切產生的兩條帶，分子量大的條帶對應經酶切后的 pET-28a片段；小片段的大小相當于含T7啟動子的SHMT片段和含T7啟動子的TPase片段之和，表明共表達質粒構建成功。

圖3 酶切鑒定 3個重組質粒 pET-SHMT、pET-TPase和pET-STFig.3 Identification of pET-SHMT, pET-TPase and pET-ST recombinant plasmids.M: DNA marker DL2000; 1: digestion of plasmid pET-28a byBglII/Hind III; 2: digestion of plasmid pET-SHMT byBglII/Hind III; 3: digestion of plasmid pET-TPase byBglII/Hind III; 4: digestion of plasmid pET-ST byBglII/Hind III.

2.3 重組基因工程菌的誘導表達及酶活測定

挑取帶有空載體的宿主菌 BL21(DE3)/pET-28a及 3種基因工程菌 BL21(DE3)/pET-SHMT、BL21(DE3)/pET-TPase和BL21(DE3)/pET-ST，分別接種到裝有20 mL LB的100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基中加入50 μg/mL卡那霉素(Kan)，37℃培養(yǎng)過夜。按1%接種量接入裝有50 mL LB的250 mL三角瓶中，37℃培養(yǎng)到OD600至 0.8～1.0，加入 IPTG 至終濃度為1 mmol/L。誘導6 h后，測定3種重組菌所產酶的活力。

將誘導6 h的2 mL細菌培養(yǎng)液離心獲菌體，水洗滌一次后加入1 mL CTAB裂解緩沖液(含0.1%CTAB、0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0))懸浮菌體，37℃溫浴30 min，離心取上清，將上清樣品和誘導6 h的全菌樣品進行SDS-PAGE電泳對比分析，結果見圖4所示。

從全菌電泳結果可見，誘導 6 h后，單表達基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和BL21(DE3)/pETTPase分別在分子量 47 kDa(SHMT)和 50 kDa(TPase)處有蛋白表達帶；共表達基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST在上述兩處位置均有蛋白表達帶。上清樣品的電泳結果表明，3種基因工程菌誘導表達的可溶性目的蛋白量占各自上清液中蛋白總量的50%以上，相比全菌中誘導表達目的蛋白的量則較少，表明誘導產生蛋白大多以包涵體形式存在。共表達基因工程菌中可溶性SHMT和TPase的蛋白量略低于單表達SHMT和單表達TPase的可溶性蛋白量。

圖4 SDS-PAGE電泳分析目的蛋白在重組菌中的表達及其可溶性Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression and solubility in recombinant strains.M: protein molecular weight markers(20.1, 29.0, 44.3, 66.4, 97.2 kDa); 1: BL21(DE3)/pET-ST; 2: BL21(DE3)/pET-TPase; 3: BL21(DE3)/pET-SHMT;4: BL21(DE3)/pET-28a; 5: soluble proteins of SHMT and TPase in BL21(DE3)/pET-ST; 6: soluble proteins of TPase in BL21(DE3)/pET-TPase; 7: soluble proteins of SHMT in BL21(DE3)/pET-SHMT.

對帶有空載體的宿主菌和3種基因工程菌進行酶活力測定，結果見圖5。攜帶空載體的宿主菌BL21(DE3)/pET-28a，兩種單表達基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT，BL21(DE3)/pET-Tpase和共表達基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST的SHMT酶活(U/mL)分別為 34.3、220.7、35.1、210.2；Tpase 酶活(U/mL)分別為13.5、12.8、113.7、93.5。相比攜帶空載體的宿主菌，兩種單表達基因工程菌 SHMT和TPase酶活分別提高了6.4倍和8.4倍；共表達基因工程菌的SHMT酶活和TPase酶活分別提高了6.1倍和6.9倍。

圖5 對照菌株、單表達及共表達基因工程菌株SHMT、TPase酶活比較Fig.5 Activity of the enzymes SHMT, TPase in different strains.1: BL21(DE3)/pET-28a; 2: BL21(DE3)/pET-SHMT; 3:BL21(DE3)/pET-TPase; 4: BL21(DE3)/pET-ST.

2.4 雙菌雙酶法合成L-色氨酸

轉化反應分為兩步在兩個反應罐中進行，第 1步反應合成L-絲氨酸，反應進行45 h達到平衡，消耗甲醛溶液(甲醛含量40%)約25 mL(25.4 g)。甲醛溶液以流加的方式加入，設定pH高于7.2開始流加甲醛，pH低于6.8停止流加。加入甲醛后，反應液pH降低，甲醛逐漸消耗后，反應液pH緩慢回升。當反應液pH持續(xù)在6.8左右不再回升，則反應達到平衡。以此方式加入甲醛，其殘留量很低，消耗的甲醛全部用于合成L-絲氨酸，以此計算甘氨酸的轉化率為83.3%。第2步，將L-絲氨酸合成反應液轉移到另一反應罐中，加入吲哚，在 TPase催化下合成 L-色氨酸，反應進行 48 h，高效液相測定 L-色氨酸的累積量為41.5 g/L。計算得到吲哚轉化率為92.5%。

2.5 單菌雙酶法合成L-色氨酸

利用共表達基因工程菌產兩種酶，使兩步合成反應在同一反應罐中同時進行。3組實驗結果見表2。

表2 原料甘氨酸和吲哚在不同投料量下單菌雙酶法合成L-色氨酸Table 2 Dual-enzymatic synthesis of L-tryptophan at different quantities of two substrates of glycine and indole

第1組實驗甘氨酸和吲哚加入量少，等體積條件下底物濃度相對較低，在加入相同菌體量的條件下，兩種底物的轉化率高，但L-色氨酸的累積量低于其他兩組。第2組和第3組實驗在反應時間、甲醛消耗量和L-色氨酸的累積量上相差甚少，但兩種底物的轉化率相差大，推測第3組實驗的底物加入過量，加入原料未被酶充分利用。第 2組實驗的原料轉化率和產物累積量均較高，其最終的L-色氨酸的累積量為28.9 g/L，故該組實驗的原料加入量為最適。相比雙菌雙酶法，單菌雙酶法在反應時間上縮短45 h，成本更節(jié)省，但L-色氨酸的累積量略低。

3 討論

以L-絲氨酸和吲哚為原料合成L-色氨酸的途徑是酶法生產L-色氨酸的重要途徑，該途徑主要缺陷是L-絲氨酸價格貴，與L-色氨酸價格幾乎相當。SHMT可利用廉價的甘氨酸和甲醛合成L-絲氨酸，克服了這一缺陷。催化這一酶促反應的除了色氨酸酶，還有色氨酸合成酶。盡管色氨酸合成酶動力學特征明顯優(yōu)于色氨酸酶，但原料之一的吲哚對其有強烈的抑制作用，而色氨酸酶對吲哚具有良好的穩(wěn)定性。因此，本研究選擇SHMT和TPase兩種酶，構建單表達SHMT基因工程菌、單表達TPase基因工程菌和共表達SHMT和TPase基因工程菌。一般認為，多基因在質粒上共表達比單獨表達時活性會降低。從本實驗結果來看，串聯在前的SHMT與單獨表達時相比酶活基本持平；串聯在后的 TPase盡管酶活不如單表達高，但與宿主菌相比提高6.9倍。單表達的表達量要顯著高于共表達，但蛋白在表達量較高的情況下，部分蛋白形成沒有活性包涵體，往往活性的大小與表達量之間呈非線性關系。

本研究所采用雙酶法合成L-色氨酸最大優(yōu)勢在于，合成L-絲氨酸后不經過分離、精制等步驟，直接用于L-色氨酸的合成，降低了成本。我們設計了兩種雙酶法合成L-色氨酸的途徑：雙菌雙酶法和單菌雙酶法。采用雙菌雙酶法合成L-色氨酸，由于兩種酶分別由兩種重組菌進行表達，其表達的可溶性蛋白量和所產生的酶的活性都要優(yōu)于兩種酶共表達。此途徑中兩步酶促反應前后分開進行，每步反應都可以在酶最適合的條件下進行，前后兩步反應不會互相影響，但反應的時間相對較長，而且反應過程中需要離心、更換反應罐等步驟，增加了成本。實驗結果顯示，利用此途徑合成L-色氨酸，底物的轉化率和產物累積量較高，從高效液相結果可知反應副產物很少。針對雙菌雙酶法途徑，今后我們需要對兩種酶的最佳反應條件(包括反應的溫度、pH和原料用量等方面)作進一步優(yōu)化，完善雙菌雙酶法的工藝，期望能提高L-色氨酸產量。單菌雙酶法的優(yōu)勢在于可大幅縮短產酶和酶促反應的時間，且共表達基因工程菌所產兩種酶的酶活并不低。但實驗結果顯示此途徑合成L-色氨酸的積累量遠低于雙菌雙酶法，分析原因可能是在同一環(huán)境中反應，需要兼顧兩種酶的反應條件，使兩者都無法達到最高的原料利用率。因此，單菌雙酶法合成L-色氨酸工藝條件仍需繼續(xù)探究，包括提高兩種酶在同一重組菌中的表達量和酶活性，以及在合成反應過程中使兩種酶同時達到相對最佳的活性，以期獲得更高的原料轉化率和產物累積量。

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Construction of co-expression SHMT and TPase recombinant vector and dual-enzymatic synthesis of L-tryptophan

Xin Li, Jun Liu, Qinqin Zhao, and Aicai Xu
College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China

Received:November 18, 2009;Accepted:June 7, 2010

Supported by:Educational Commission of Hubei Province of China(No.D200718002).

Corresponding author:Jun Liu.Tel: +86-27-83956793; E-mail: Junliu85@yahoo.com.cn湖北省教育廳重點項目(No.D200718002)資助。