孫宗濤，田兵，沈紹傳，華躍進

1 浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310029

2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)所，杭州 310021

細胞工廠的優(yōu)化

耐輻射奇球菌類胡蘿卜素C3',4'-脫氫酶底物特異性

孫宗濤1,2，田兵1，沈紹傳1，華躍進1

1 浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310029

2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)所，杭州 310021

為了鑒定耐輻射奇球菌類胡蘿卜素C3',4'-脫氫酶 (DR2250) 催化底物的特異性，利用PCR方法將dr2250基因的克隆到載體 pUC19上，形成了重組載體 pUC-CRTD。利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化方法將不同組合的質(zhì)粒 pACCRT-EBIEu、pRK-CRTC和pUC-CRTD轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選陽性克隆并提取其色素進行產(chǎn)物分析。結(jié)果表明，DR2250修飾的底物具有選擇性，它不能以未經(jīng)過羥基化修飾的直鏈類胡蘿卜素為底物，而能在C1(1') 羥基修飾的羥基化類胡蘿卜素的基礎(chǔ)上進行C3',4'-脫氫反應(yīng)。

耐輻射奇球菌，類胡蘿卜素，C3',4'-脫氫酶, 底物特異性

Abstract:To examine the substrate specificity of carotenoid 3',4'-desaturase (DR2250) fromDeinococcusradiodurans, we amplified thedr2250gene by using PCR methods. The PCR products were digested byHind III-BamH I and ligated into the vector pUC19, yielding recombinant vector pUC-CRTD. We analyzed the carotenoids ofE.colitransformants containing pACCRT-EBIEuand (or) pRK-CRTC and (or) pUC-CRTD. Our results demonstrated that DR2250 had substrate specificity on the carotenoids with hydroxyl group at C1 (1').

Keywords:Deinococcusradiodurans, carotenoid, C3',4'-desaturase, substrate specificity

耐輻射奇球菌Deinococcus radiodurans(DR)是一種紅色的、非流動性、不產(chǎn)生孢子的球形細菌。該細菌以對電離輻射、UV輻射、干燥等各種DNA損傷試劑具有超強的抗性而著稱，它能在幾個小時內(nèi)準(zhǔn)確地修復(fù)由輻射產(chǎn)生的幾十個雙鏈 DNA碎片[1]。研究報道稱，電離輻射產(chǎn)生約80%的DNA損傷由輻射水解產(chǎn)生的活性氧自由基 (Reactive oxygen species，ROS) 攻擊DNA造成的[2]，負責(zé)清除自由基的抗氧化系統(tǒng)對DR菌的抗性有著重要的貢獻。

類胡蘿卜素 Deinoxanthin作為DR菌非酶類抗氧化系統(tǒng)中的一種特殊天然化合物，能有效地清除過氧化氫 (H2O2)，猝滅單線態(tài)氧 (1O2) 等活性氧自由基，我們實驗室的研究證明這種特殊結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素比其他類胡蘿卜素有更高的自由基清除能力[3]。這種高效的自由基清除能力主要歸功于deinoxanthin中存在著的多種活性基團如 C3',4'-雙鍵、C1'-羥基、C4-酮基[4]。我們通過分子生物學(xué)方法對參與 deinoxanthin生物合成途徑的合成酶進行了系統(tǒng)的研究，鑒定了八氫番茄紅素合成酶 (CrtB，DR0862)[3]、八氫番茄紅素脫氫酶 (CrtI，DR0861)[5]、C3',4'-脫氫酶 (CrtD，DR2250)[6]、C1',2'-水合酶(CruF，DR0091)[7]和 C4-酮基化酶 (CrtO，DR0093)[8]。通過對上述這些合成酶的突變體分析以及色素產(chǎn)物抗氧化能力實驗，我們得知這些活性基團對 DR菌的輻射抗性有著重要的貢獻。這些活性基團合成酶中，C3',4'-脫氫酶 (CrtD) 負責(zé)催化在類胡蘿卜素的 C-3(3')，4(4')上脫氫形成不飽和鍵。在DR菌中，我們通過構(gòu)建DR2250突變體研究得知其編碼 C3',4'-脫氫酶，然而 DR2250所編碼蛋白的催化功能的底物特異性卻還不清楚，以下將圍繞著DR2250的底物選擇性展開研究。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒、試劑和主要儀器

大腸桿菌Escherichia coliDH5α和耐輻射奇球菌D. radioduransR1為本實驗室保存。質(zhì)粒pACCRT-EBIEu(德國Goethe大學(xué)Sandmann教授提供)、pRK-CRTC為實驗室保存。質(zhì)粒 pUC19、pMD18均購自TaKaRa公司。氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素購自上海生物工程公司，引物合成由上海生物工程公司完成，HPLC級乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑購自美國 Tedia公司，PCR純化和膠回收試劑盒購自 TaKaRa公司，基因組提取試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自百泰克公司，DNA測序反應(yīng)均委托上海英駿公司完成。實驗儀器包括：Waters 2695 Alliance高效液相色譜儀 (HPLC)、PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)Model-3000 (美國Bio-Rad公司) 等。

1.2 基因克隆與重組載體構(gòu)建

耐輻射奇球菌在 30℃用 TGY液體培養(yǎng)基(5 g/L胰蛋白胨，3 g/L酵母提取物，1 g/L葡萄糖) 培養(yǎng)過夜，利用基因組提取試劑盒進行基因組的提取。設(shè)計引物：P1：5′-CgGTaagctt GATGATACTGCTCCC GCTACACTGC-3′ (下劃線部分為Hind III 位點)，P2：5′-CAGCggatcc CGGTCCGCCATAAGAATCAA G-3′ (下劃線部分為BamH I位點)，以野生型R1基因組作為模板，進行PCR擴增，獲得 PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳的方法進行純化，純化片段再經(jīng)HindIII和BamH I雙酶切后電泳割膠回收；回收純化片段并連接到同樣雙酶切的pUC19質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并最終獲得重組質(zhì)粒pUC-CRTD。重組表達質(zhì)粒經(jīng)過測序驗證，確定沒有任何堿基發(fā)生突變和移碼。

1.3 不同重組轉(zhuǎn)化體的獲得

不同組合的質(zhì)粒 pACCRT-EBIEu、pRK-CRTC和pUC-CRTD利用常規(guī)CaCl2轉(zhuǎn)化方法分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在 LB抗性平板進行篩選，挑取陽性克隆并進行質(zhì)粒酶切鑒定。

1.4 菌體合成色素產(chǎn)物的鑒定

將上述獲得的重組大腸桿菌菌株轉(zhuǎn)入 100 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至OD600≈0.5，加IPTG(0.5 mmol/L) 誘導(dǎo)，250 r/min繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，6 000 r/min離心10 min收集細胞，使用緩沖液清洗2次后，使用丙酮/甲醇溶液 (7∶2，V/V) 提取菌體色素。

通過HPLC方法對大腸桿菌合成的色素進行分析，色譜分析條件如下：Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng)，Hypersil ODS-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，Waters-Millennium 32 色譜工作站，Waters 996光電二極管檢測儀檢測波長200～800 nm，流動相使用乙腈-甲醇-異丙醇 (40∶50∶10，V/V/V)，流速1 mL/min，柱溫35℃，進樣體積20 μL。

2 結(jié)果

2.1crtD基因的克隆與載體pUC-CRTD的構(gòu)建

以耐輻射奇球菌R1菌株基因組為模板，通過體外PCR擴增的方法獲得DR2250全基因產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物與理論值相同，大小為1 476 bp(圖 1)。經(jīng)過HindIII和BamH I雙酶切后的 PCR產(chǎn)物和同樣雙酶切過的載體pUC19在T4 DNA連接酶的作用下形成重組載體 pUC-CRTD。經(jīng)過酶切電泳驗證 (圖 1) 和測序，重組載體 pUC-CRTD構(gòu)建正確。

圖1crtD基因和重組載體pUC-CRTD的酶切電泳鑒定圖Fig.1 PCR product of thecrtDgene and confirmation of recombinant plasmid pUC-CRTD. 1: PCR product of thecrtDgene; 2: pUC19 vector digested byHindIII andBamH I; 3:the recombinant vector pUC-CRTD digested byHindIII andBamH I; 4: marker.

2.2 CrtD蛋白功能分析

為了驗證 DR2250蛋白的功能和底物特異性，我們利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的方法來檢驗其功能。質(zhì)粒pACCRT-EBIEu在大腸桿菌中能產(chǎn)生番茄紅素，而質(zhì)粒pRK-CRTC則能在番茄紅素的基礎(chǔ)上通過水合反應(yīng)產(chǎn)生羥基化的番茄紅素[9]。首先構(gòu)建了能表達DR2250的克隆載體 pUC-CRTD，然后利用常規(guī)CaCl2轉(zhuǎn)化方法分別轉(zhuǎn)化上述不同組合的質(zhì)粒混合物，得到的克隆經(jīng)過鑒定后，提取類胡蘿卜素進行液相色譜分析。

HPLC分析結(jié)果如圖 2所示，只含有質(zhì)粒pACCRT-EBIEu的大腸桿菌中產(chǎn)生番茄紅素 (圖2，峰6)。當(dāng)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACCRT-EBIEu和 pUC-CRTD時大腸桿菌也只產(chǎn)生一種類胡蘿卜素 (峰 6)，其保留時間和吸收光譜與番茄紅素相同 (圖 3)，這表明當(dāng) DR2250表達在產(chǎn)生番茄紅素的大腸桿菌中不能使其發(fā)生脫氫反應(yīng)，因此，DR2250并不能以番茄紅素為底物。當(dāng)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pACCRT-EBIEu和pRK-CRTC到大腸桿菌后產(chǎn)生3種類胡蘿卜素，根據(jù)它們的保留時間、吸收光譜 (圖3) 以及對照以前的文獻[10-11]，這3個產(chǎn)物分別為1,1'-二羥基-番茄紅素 (圖 2，峰 3)、1-羥基-番茄紅素 (圖2，峰 5) 和番茄紅素 (圖2，峰6)。當(dāng)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACCRT-EBIEu、pRK-CRTC和pUC-CRTD時，類胡蘿卜素組成發(fā)生了明顯的變化 (圖2)，產(chǎn)生了3個新的產(chǎn)物峰1、峰 2、峰 4。峰 4 (λmax=456，483，517 nm) 與峰 5(λmax=445，471，502 nm) 相比發(fā)生了紅移約10 nm(圖 3)。

圖2 DR2250蛋白功能分析Fig.2 HPLC analysis of carotenoids in lycopene-producingE.colitransformants containing the plasmids pACCRT-EBIEu;pACCRT-EBIEuand pUC-CRTD; pACCRT-EBIEuand pRK-CRTC; pACCRT-EBIEu, pRK-CRTC and pUC-CRTD.Peak 1: 1,1’-(OH)2-3,3',4,4'-tetradehydrolycopene; peak 2:1,1’-(OH)2-3,4,-didehydrolycopene; peak 3: 1,1’-(OH)2-lycopene;peak 4: 1-OH-3,4,-didehydrolycopene; peak 5: 1-OH-lycopene;peak 6: lycopene.

圖3 峰1～6的紫外可見吸收光譜圖Fig.3 UV-vis spectrum for peak 1?6 inE. colitransformants.

類胡蘿卜素碳骨架上規(guī)律性排列的共軛雙鍵系統(tǒng)使得類胡蘿卜素在可見光區(qū)以及在紫外區(qū)具有特征吸收峰，而類胡蘿卜素的吸收光譜與共軛雙鍵的數(shù)目有關(guān)，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律性[9]：類胡蘿卜素的最大吸收光值 (λmax) 與共軛雙鍵數(shù)目有關(guān)，λmax隨著共軛雙鍵數(shù)目的增加而增大。按照此理論，每增加一個共軛雙鍵，λmax值就會向長波方向移動10 nm[12]。羥基、甲氧基、含氧的非共軛基團不會影響λmax值。對于無環(huán)化的類胡蘿卜素如番茄紅素，它的共軛系統(tǒng)是以接近平面的構(gòu)型存在的，所以它的吸收光譜圖是尖的精細的三指狀吸收峰。因此，UV-Vis λmax值、光譜的形狀都可以作為鑒定類胡蘿卜素化學(xué)結(jié)構(gòu) (尤其是共軛雙鍵結(jié)構(gòu)) 的一種重要依據(jù)。這意味著峰4比峰5多一個共軛雙鍵。我們以前的實驗結(jié)果表明DR2250編碼類胡蘿卜素C3,4-脫氫酶[6]，因此，可以判斷峰4產(chǎn)物是在峰5產(chǎn)物的C-3,4位置上脫氫得到的，其結(jié)構(gòu)為1-羥基-3,4-雙脫氫-番茄紅素。同樣的比較峰2與峰3的吸收光譜，峰2 (λmax=456，483，517 nm) 比峰 3 (λmax= 445，471，502 nm)發(fā)生了紅移約 10 nm，同樣意味著峰 2產(chǎn)物比峰 3產(chǎn)物多一個共軛雙鍵數(shù)目，峰2產(chǎn)物是在峰3產(chǎn)物的C-3,4位置脫氫得到的，其結(jié)構(gòu)為1,1'-二羥基-3,4-雙脫氫-番茄紅素。觀察峰 1的吸收光譜圖，它(λmax= 466，495，528 nm) 比峰2和峰3分別大了10多納米和20多納米，意味著峰1產(chǎn)物有著比峰2產(chǎn)物更多的共軛雙鍵數(shù)目，它是在峰2產(chǎn)物的C-3,4位置上再進一步脫氫產(chǎn)生的，其結(jié)構(gòu)為1,1'-二羥基-3,3',4,4'-四脫氫-番茄紅素。

根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們可以看出，DR2250不能直接以未經(jīng)過羥基化修飾的番茄紅素為底物，而能在 C1 (1') 羥基修飾的羥基化類胡蘿卜素基礎(chǔ)上催化發(fā)生脫氫反應(yīng)。

3 討論

Deinoxanthin作為耐輻射奇球菌中主要的類胡蘿卜素，其高效的清除自由基的能力已經(jīng)得到驗證，但其體內(nèi)的合成途徑卻沒有完全闡明。我們以前的研究結(jié)果表明DR2250蛋白參與了deinoxanthin的生物合成，負責(zé)催化 C3',4'-脫氫反應(yīng)，但其催化的底物特異性卻沒有足夠?qū)嶒炞C實。本文利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化實驗揭示了CrtD的催化底物是具有選擇性的，它不能識別 C1(1')位沒有羥基修飾的類胡蘿卜素，而能在C1(1')位存在羥基基團的基礎(chǔ)上進行脫氫反應(yīng)。由此也可以驗證 DR2250所催化的脫氫反應(yīng)在耐輻射奇球菌deinoxanthin生物合成途徑中是在C1位羥基化以后發(fā)生的。對 DR2250蛋白底物特異性的研究有助于我們深入了解 deinoxanthin生物合成途徑中的反應(yīng)步驟，同時這一特性將對構(gòu)建工程菌株合成具有高效自由基清除能力的類胡蘿卜素具有重要意義。

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Substrate specificity of carotenoid 3',4'-desaturase fromDeinococcus radiodurans

Zongtao Sun1,2, Bing Tian1, Shaochuan Shen1, and Yuejin Hua1

1Institute of Nuclear-Agricultural Sciences,Zhejiang University,Hangzhou310029,China
2Department of Virology and Biotechnology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou310021,China

Received:June 2, 2010;Accepted:September 10, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707804), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021305), National Natural Science Foundation of China (Nos. 30830006, 30670026, 30870035), Project‘Application of Nuclear Techniques in Agriculture’ from the Chinese Ministry of Agriculture (No. 200803034).

Corresponding author:Yuejin Hua. Tel/Fax: +86-571-86971703; E-mail: yjhua@zju.edu.cn

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707804)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2007AA021305)，國家自然科學(xué)基金項目 (Nos. 30830006, 30670026, 30870035)，農(nóng)業(yè)部核技術(shù)農(nóng)業(yè)應(yīng)用項目 (No. 200803034) 資助。