楊俊杰，范文超，肖晗，關(guān)春鴻，曹傳增,，邵海峰，姜衛(wèi)紅，楊晟,

1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點實驗室，上海 200032

2 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

3 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心，湖州 313000

4 浙江順風(fēng)海德爾有限公司，東陽 322100

細(xì)胞工廠的構(gòu)建技術(shù)

枯草芽胞桿菌基因組混組方法

楊俊杰1,2，范文超3，肖晗1，關(guān)春鴻1，曹傳增1,3，邵海峰4，姜衛(wèi)紅1，楊晟1,2,3

1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點實驗室，上海 200032

2 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

3 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心，湖州 313000

4 浙江順風(fēng)海德爾有限公司，東陽 322100

基因組混組作為一種育種方法，通過循環(huán)原生質(zhì)體融合等手段，使得不同菌株來源的基因組能夠得到充分重組，增加將正向突變整合到同一重組子中的機會。使用4株帶有4種不同標(biāo)記的枯草芽胞桿菌親本為初始菌株，通過循環(huán)轉(zhuǎn)化、循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)或循環(huán)原生質(zhì)體融合的手段進行基因組混組，統(tǒng)計后代中非親本類型占整個群體的比例，以衡量基因組混組的效果。分別經(jīng)過 5輪循環(huán)原生質(zhì)體融合、循環(huán)轉(zhuǎn)化或者循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果顯示，重組程度較高者在后代群體中的比例較低，帶有4種標(biāo)記的后代未出現(xiàn)，帶有3種標(biāo)記的后代最高分別為4.53×10?4、1.64×10?4、4.47×10?3，明顯低于文獻報道的天藍色鏈霉菌中同樣實驗的結(jié)果：帶4種和3種標(biāo)記的后代分別占2.5%、17%。對比上述實驗的結(jié)果和文獻報道的天藍色鏈霉菌、乳桿菌基因組混組的結(jié)果，并結(jié)合計算機模擬循環(huán)融合過程，分析后認(rèn)為:要達到較充分的基因組混組，需要有能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細(xì)胞間高頻重組的操作技術(shù)作為基礎(chǔ)，重組頻率應(yīng)該不低于10?3～10?2數(shù)量級。

基因組混組，枯草芽胞桿菌，分子育種，原生質(zhì)體融合，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，計算機模擬

Abstract:Genome shuffling methods were explored forBacillus subtilisstrain molecular breeding. Recycling protoplast fusion,recycling transformation and recycling universal transduction were used for genome shuffling inB. subtilis. Four strains with different nutrition-deficiency markers were used as initial strains. After five rounds protoplast fusion, transformation or transduction,the descendant with 4 markers had not been detected, and the rate of descendant with 3 markers were 4.53×10?4, 1.64×10?4,4.47×10?3, respectively. A computer program was made to simulate the recycling fusion process. Based on simulation result andcomparing the genome shuffling result ofB. subtilisin this experiment and that ofStreptomyces coelicolorreported in references,effective genome shuffling needs a high recombination rate of at least between 10?3and 10?2.

Keywords:genome shuffling,Bacillus subtilis, molecular breeding, protoplast fusion, transformation, transduction,in silicosimulation

優(yōu)良菌種選育是發(fā)酵工程的核心技術(shù)。傳統(tǒng)的手段有誘變育種和雜交育種。常規(guī)的誘變育種方法是以紫外線、輻射或化學(xué)誘變劑處理微生物，產(chǎn)生大量突變，再以所需指標(biāo)進行篩選。由于負(fù)突變的比例非常高，一般要篩選 105以上突變體才能得到一個正突變[1]。經(jīng)過長期誘變獲得的菌株在特定性狀有所改善的同時，一般積累很多有害突變，比如生長條件要求變苛刻、生存能力變差、細(xì)胞變“脆弱”等。雜交育種選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，結(jié)果大多可以獲得優(yōu)于親本菌株的后代菌株。利用雜交育種往往還可消除誘變獲得的菌株所帶的缺陷[1]。

基因組混組 (Genome shuf fl ing) 是在雜交育種的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的新育種方法。首先通過經(jīng)典的誘變育種等方法獲得多個得到改良的菌株，而后通過循環(huán)原生質(zhì)體融合等手段，使得不同菌株來源的基因組能夠得到充分重組，增加將正向突變整合到同一重組子中的機會，同時，積累的有害突變可被其他菌株的野生型序列所代替。希望最終可以獲得一批性能改良的重組子。這種思路最初是從 DNA 混組(DNA shuf fl ing) 中的退火步驟得到啟發(fā)，對原生質(zhì)體融合育種技術(shù)作了改進，將融合后的菌株不經(jīng)篩選就進行下一輪融合，經(jīng)過這樣反復(fù)多次的操作以后才進行篩選，從而使得再生菌落的基因組重組程度大幅度提高。

基因組混組的用于微生物育種過程，其具體操作過程分為 3個步驟[2]。第一步是建立用于混組的初始群體。如果初始群體不好，那么無論后面的步驟做得如何，最終也將難以獲得具有預(yù)期性狀的后代。初始群體的獲得，可以使用傳統(tǒng)育種的方法，比如通過傳統(tǒng)誘變篩選等技術(shù)獲得一批性狀有所改善的初始菌株。野生型菌株或者代謝工程改造獲得的菌株，也可能作為混組初始群體的成員[3]。第二步，使用原生質(zhì)體融合等技術(shù)手段，使初始群體中多個親本基因組之間發(fā)生充分的交換和重組。常規(guī)單輪原生質(zhì)體融合用于 2個親本間的基因組交換重組較為有效，但是融合過程中多個細(xì)胞碰撞到一起融合的概率較低。為了實現(xiàn)多親本基因組之間的交換重組，引入了循環(huán)原生質(zhì)體融合的手段。即多個初始群體中多種類型的親本細(xì)胞同時制備原生質(zhì)體，混合后進行一輪融合；而后收集融合后獲得的后代再生細(xì)胞，作為一個群體進行培養(yǎng)。而后制備原生質(zhì)體，進行新一輪融合。融合過程重復(fù)多輪。第三步，使用特定的篩選方法將具有期望性狀的后代細(xì)胞篩選出來。這一步需要根據(jù)育種具體目的采取相應(yīng)的方案。循環(huán)融合獲得的后代細(xì)胞庫可能非常大，此時需要有相應(yīng)的高通量篩選手段以便從中篩選到具有更好性狀者[1]。

2002年Zhang等首次應(yīng)用基因組混組技術(shù)提高弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae的泰樂菌素產(chǎn)量。經(jīng)1次誘變育種加上2輪基因組混組，歷時1年，得到了2株高產(chǎn)菌株GS1和GS2，其生產(chǎn)能力和通過傳統(tǒng)誘變技術(shù)獲得的高產(chǎn)菌 SF21的生產(chǎn)能力相當(dāng)。而SF21的獲得歷經(jīng)20輪誘變、歷時20年[4]。同一年，Patnaik等通過基因組混組提高乳桿菌Lactobacillussp.耐酸性，經(jīng)5輪循環(huán)融合后，篩選得到的新菌株可以在出發(fā)株不能生長的酸性環(huán)境pH 3.5條件下生長。同時，在pH 4.0的條件下該菌株的乳酸產(chǎn)量比野生型菌株提高了3倍[5]。如文獻[2]所綜述，近幾年來又有了較多的關(guān)于此種技術(shù)應(yīng)用的報道。

基因組混組在芽胞桿菌中的應(yīng)用有以下一些報道。梁惠儀等以具有纖溶酶活性的枯草芽胞桿菌DC-12為初始菌株，首先通過進行紫外誘變和亞硝酸誘變。而后選取 4株誘變菌株作為直接親本，采用電融合的方法進行 2次多親本的基因組混組，共篩選出 2株酶活大大提高并能穩(wěn)定遺傳的菌株，酶活提高了 4～5倍[6]。陳亮等首先對枯草芽胞桿菌BS14進行誘變，而后使用獲得3株菌UV22-5、HN8-7和HN18-3為初始菌株進行了3輪基因組混組，獲得了1株穩(wěn)定菌株F35。F35對真菌尖孢鐮刀菌甜瓜?；虵usarium oxysporumf. sp.melonis的抗性比 HN8-7和 BS14分別提高了 34.52%和65.48%[7]。

在芽胞桿菌中，尚沒有報道對于多輪融合后基因組混組的效果進行較系統(tǒng)的研究。本研究以枯草芽胞桿菌為材料，研究了多輪融合過程中基因組混組程度的改變。除此之外，也將循環(huán)轉(zhuǎn)化和循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)這2種手段引入基因組混組的工作，探索了多輪轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，基因組混組程度的改變。根據(jù)這些實驗結(jié)果以及通過計算機模擬循環(huán)融合過程，推斷要達到高效的基因組混組，需要有能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細(xì)胞以較高頻率獲得重組的操作技術(shù)作為基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基使用 LB、TB、SOC培養(yǎng)基。抗生素濃度分別為氨芐青霉素100 mg/L、壯觀霉素50 mg/L、卡那霉素50 mg/L、氯霉素5 mg/L。所用的其他材料為常規(guī)材料。

1.2 菌株、質(zhì)粒和噬菌體

本研究中構(gòu)建和使用的質(zhì)粒見表1。

構(gòu)建的枯草芽胞桿菌菌株和噬菌體見表 2。本研究中部分菌株構(gòu)建過程如圖1所示，具體如下：

表1 本研究中使用或構(gòu)建的質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究中使用或構(gòu)建的菌株和噬菌體株Table 2 Strains used in this study

圖1 本研究中枯草芽胞桿菌菌株構(gòu)建過程Fig.1 Constructinon ofBacillus subtilisstrains.

用整合載體pSG1190轉(zhuǎn)化QB917 (hisA1，thr5，trpC2)，在 QB917基因組上的 amyE基因的位置上插入一個壯觀霉素抗性基因，得到 MMF1(hisA1，thr5，trpC2，SpcR)。以 QB944(purA16，cysA14，trpC2)作為 DNA供體，MMF1作為受體，獲得 MMF2(purA16，thr5，trpC2，SpcR)。

以原養(yǎng)型 SB491作為 DNA供體，以 QB934(tre12，metC3，glyB133，trpC2) 作為受體菌，轉(zhuǎn)化得到 MMF3 (metC3)。用 PCR方法把 MMF3中的metC3基因緊鄰下游的基因擴增出來，克隆到整合載體pBGSC6中，得到pBGSC6M。用pBGSC6M轉(zhuǎn)化MMF3,得到MMF4 (metC3，CmR)。以 MMF4作為DNA供體，MMF2作為受體菌，分別以不同條件篩選轉(zhuǎn)化子，并對獲得的轉(zhuǎn)化子進行鑒定。最終獲得 4株菌株，分別是：MMF5 (purA16，thr5，trpC2)，MMF6 (purA16，metC3，trpC2)，MMF7 (thr5，metC3，trpC2)，MMF8 (purA16，thr5，metC3)。

1.3 循環(huán)融合

取MMF5、MMF6、MMF7、MMF8的過夜培養(yǎng)物，等比例混合作為初始群體，計作為F0。

將F0群體制備原生質(zhì)體，加入PEG 以介導(dǎo)融合，涂布于非選擇性的再生平板。將再生平板上獲得的全部菌落以無菌水洗下，獲得的菌體懸液為F1。同樣的，以F1群體制備原生質(zhì)體并進行融合，獲得的下一代群體定義為F2。以后各代依次為F3、F4、F5。具體過程如圖2所示。

取各代梯度稀釋后涂布于添加不同氨基酸或堿基的基本培養(yǎng)基，計數(shù)各代中各種基因型細(xì)胞的數(shù)目并計算它們在群體中所占的比例。

原生質(zhì)體的制備和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合的具體實驗方法參照文獻[13]報道，高滲溶液使用SMMP + BSA，再生培養(yǎng)基使用DM3培養(yǎng)基。

圖2 3種技術(shù)手段進行基因組混組示意圖Fig.2 Perform genome shuffling by recycling protoplast fusion, transformation or transduction.

1.4 循環(huán)轉(zhuǎn)化

和 1.3節(jié)一樣，取MMF5、MMF6、MMF7、MMF8的過夜培養(yǎng)物，等比例混合作為初始群體，計作為F0。抽提F0群體的基因組，并且轉(zhuǎn)化F0群體的感受態(tài)細(xì)胞，獲得的下一代群體定義為F1。同樣，基因組轉(zhuǎn)化F1，獲得的下一代群體定義為F2。以后各代的依次為 F3、F4、F5。具體過程如圖 2所示。

取各代細(xì)胞梯度稀釋后涂布于添加不同氨基酸或堿基的基本培養(yǎng)基，計數(shù)各代中各種基因型細(xì)胞的數(shù)目并計算在群體中所占的比例。

為了確定每一批的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率與基因組制備質(zhì)量，引入了輔助菌株 FW7E。每一代進行過程中，F(xiàn)W7E基因組轉(zhuǎn)化Fn (Fn代表F0、F1……)，用于檢驗感受態(tài)效率；同時，使用 Fn 基因組轉(zhuǎn)化FW7E，用于檢驗基因組抽提質(zhì)量。

抽提基因組與制備感受態(tài)的具體實驗方法參照文獻[13]報道。

1.5 循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)

和1.3節(jié)一樣，取 MMF5、MMF6、MMF7、MMF8的過夜培養(yǎng)物，等比例混合作為初始群體，計作為F0。

將F0群體的一部分用噬菌體PBS1感染，制備裂解液。裂解液感染F0群體，獲得的下一代群體定義為 F1。同樣地，以 F1群體制備噬菌體裂解液感染 F1群體，獲得的下一代群體定義為 F2。以后各代的依次為F3、F4、F5。具體過程如圖2所示。

取各代梯度稀釋后涂布于添加不同氨基酸或堿基的基本培養(yǎng)基，計數(shù)各代中各種基因型細(xì)胞的數(shù)目并計算它們在整個群體中所占的比例。

轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體實驗方法參照文獻[13]報道。

1.6 循環(huán)融合過程的電子模擬

編制程序，模擬含有 108個細(xì)胞的群體，以不同的重組頻率，經(jīng)過 5輪融合后，后代中各種基因型的所占比例的變化。

模擬過程使用窮舉算法。以重組頻率10%為例對算法進行具體說明：首先取出一個細(xì)胞，根據(jù)初始比例得到其基因型。有10%可能性這個細(xì)胞參加了融合和重組，則根據(jù)親本基因型確定融合子基因型，計算產(chǎn)生下一代的細(xì)胞。剩余90%可能性，這個細(xì)胞在本輪融合過程中沒有參加重組，即可能沒有參加融合，保持親本類型；也可能細(xì)胞暫時融合后，形成異核體，而后基因組沒有進行重組而迅速分離成親本類型，那么又按照其基因型不變，產(chǎn)生下一代的細(xì)胞。每一輪融合模擬計算 108個細(xì)胞，產(chǎn)生108個后代細(xì)胞。共模擬計算5輪。

FORTRAN95程序源代碼如附錄。使用ThinkPad T400 硬件系統(tǒng)，UBUNTU8.10、GFORTRAN 7.4軟件系統(tǒng)，不同的重組頻率參數(shù)下，分別重復(fù)運行 4次，取平均值。記錄模擬的結(jié)果，并與實驗結(jié)果以及文獻報道進行對比分析。

2 結(jié)果

2.1 進行基因組混組的初始菌株

本實驗首先獲得的4株帶有3缺陷的菌株，即MMF5、MMF6、MMF7、MMF8。對于purA16、thr5、metC3、trpC2 這4個位點，上述每一菌株分別帶有1個原養(yǎng)型標(biāo)記、3個缺陷型標(biāo)記：MMF5 (purA16，thr5，trpC2，MetC3+)、MMF6 (purA16，metC3，trpC2，Thr5+)、MMF7 (thr5，metC3，trpC2，PurA16+)、MMF8 (purA16，thr5，metC3，TrpC2+)，其中粗體且首字母大寫的為原養(yǎng)型正標(biāo)記。

這些標(biāo)記在基因組上的位置如圖 3所示；從上面的正標(biāo)記的位置圖可以看出來，4個標(biāo)記在基因組上分布均勻。通過鑒定這4個菌株的后代群體中，帶有2個或2個以上原養(yǎng)型正標(biāo)記的個體的數(shù)量和所占的比例，可以比較基因組混組的效率。

2.2 原生質(zhì)體的制備、再生與融合

經(jīng)過實驗條件摸索，確定了原生質(zhì)體的制備、再生與融合的具體方案和參數(shù)。維持原生質(zhì)體穩(wěn)定的等滲溶液使用 SMMP (+BSA)。主要穩(wěn)定劑是蔗糖，緩沖體系是磷酸鹽和順丁烯二酸鹽，BSA用于提高再生率。溶菌酶濃度為2 mg/mL，37℃～39℃處理1～2 h，鏡檢觀察至沒有桿菌殘留時停止溶菌酶處理。再生培養(yǎng)基選用DM3培養(yǎng)基，主要穩(wěn)定劑和緩沖體系是丁二酸鹽。融合方法使用PEG法，處理條件為40% PEG6000 冰浴1～2 min。

經(jīng)多次重復(fù)，原生質(zhì)體形成率，即原生質(zhì)體數(shù)/(原生質(zhì)體數(shù)+剩余桿菌數(shù))，一般大于99.9%；原生質(zhì)體再生率，即 (再生菌數(shù)?剩余桿菌數(shù))/(細(xì)胞總數(shù)?剩余桿菌數(shù))，為10%左右；單次融合過程中重組頻率，即后代群體中重組體總數(shù)/后代群體總數(shù)，在10?5左右。這些都符合文獻[14]報道。

圖3purA16、thr5、metC3、trpC2 4個基因枯草芽胞桿菌在染色體上的位置Fig.3 Positions ofpurA16,thr5,metC3 andtrpC2onBacillus subtilischromosome.

2.3 循環(huán)融合實驗的結(jié)果

循環(huán)融合實驗的結(jié)果見表 3。從中可以看出，經(jīng)過5輪轉(zhuǎn)化，其中同時帶有4個標(biāo)記的融合子沒有穩(wěn)定出現(xiàn)。帶有3個和2個標(biāo)記的后代，總體上有增加的趨勢。

表3 五輪循環(huán)融合過程中各類型枯草芽胞桿菌后代的數(shù)量以及在群體中所占的比例Table 3 Counts and rates of descendant with 2, 3 and 4 markers in five rounds protoplast fusion

2.4 電子模擬循環(huán)融合過程的結(jié)果

分別把重組頻率設(shè)定為 10?5、10?4、10?3、10?2、10?1作為參數(shù)，運行模擬程序。模擬 5輪融合后，含有多個標(biāo)記的細(xì)胞在后代群體中所占的比例如表4所示。

對比實驗結(jié)果和模擬結(jié)果。天藍色鏈霉菌的實驗結(jié)果和重組頻率 10?1的模擬結(jié)果相互對應(yīng)，帶 4個標(biāo)記的后代4到五輪融合后達到10?2數(shù)量級。枯草芽胞桿菌的實驗結(jié)果和重組頻率10?4左右的模擬結(jié)果相互對應(yīng)。帶4個標(biāo)記的后代5輪融合后沒有出現(xiàn)，帶有 3個標(biāo)記出現(xiàn)但比例不高?？紤]到生長過程中帶有更多個原養(yǎng)型標(biāo)記基因的后代會略有優(yōu)勢。電子模擬過程基本上符合了實際的情況。

表 4 模擬不同重組頻率下五輪融合后各類型枯草芽胞桿菌后代在群體中所占的比例Table 4 Rates of descendant with 2,3 and 4 markers after five rounds simulation protoplast fusion

表 5 天藍色鏈霉菌和枯草芽胞桿菌循環(huán)融合實驗結(jié)果比較Table 5 Comparison of the result of cycling protoplast fusion ofB. subitilisandS. colicolor

2.5 轉(zhuǎn)化效率與轉(zhuǎn)化頻率

經(jīng)過多次重復(fù)實驗中，單次轉(zhuǎn)化過程中重組頻率基本可以保證在10?3數(shù)量級，也符合文獻[15]報道。

2.6 循環(huán)轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果

循環(huán)轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果見表 6。從中可以看出，經(jīng)過5輪轉(zhuǎn)化，其中同時帶有4個標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子沒有穩(wěn)定出現(xiàn)。帶有3個和2個標(biāo)記的后代，總體上處于增加的趨勢。

2.7 噬菌體效價和轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率

裂解液效價在108PFU/mL以上。單次轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重組頻率 7.0×10?7～2.0×10?6之間，符合文獻[15]報道。

2.8 循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗的結(jié)果

循環(huán)轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果見表 7。從中可以看出，經(jīng)過五輪轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中同時帶有4個標(biāo)記的轉(zhuǎn)導(dǎo)子沒有穩(wěn)定出現(xiàn)。帶有3個和2個標(biāo)記的后代，總體上處于增加的趨勢。

表6 五輪循環(huán)轉(zhuǎn)化過程中各類型枯草芽胞桿菌后代的數(shù)量以及在群體中所占的比例Table 6 Counts and Rates of descendant with 2, 3 and 4 markers in five founds transformation

表7 五輪循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中各類型枯草芽胞桿菌后代在群體中所占的比例Table 7 Counts and rates of descendant with 2, 3 and 4 markers in five rounds transduction

3 討論

據(jù)報道，使用4株帶有4個不同標(biāo)記基因的天藍色鏈霉菌S. coelicolor為實驗材料進行基因組混組實驗，經(jīng)過4輪原生質(zhì)體融合，帶有4個標(biāo)記基因的后代在群體中的比例達到了 2.5%，帶有 3個和2個遺傳標(biāo)記的后代所占的比例分別到達17%和60%[4]。根據(jù)本研究的結(jié)果，使用枯草芽胞桿菌做相同的實驗，經(jīng)過5輪原生質(zhì)體融合，帶有4個標(biāo)記的后代沒有出現(xiàn)。在3輪融合后帶有3個遺傳標(biāo)記的后代開始出現(xiàn)。5輪后帶有 3個遺傳標(biāo)記的后代最終比例是 10?5，帶有 2個遺傳標(biāo)記的后代所占的比例也在10?3數(shù)量級。

究其原因，在于各種微生物細(xì)胞重組頻率差別很大。天藍色鏈霉菌融合過程中重組頻率在10?1數(shù)量級，最高達到17%。鏈霉菌循環(huán)融合實驗中，第1輪融合后，重組子比率達到8.4%[4]。這樣，前一輪融合獲得的重組子，有很大機會參加第 2輪融合而產(chǎn)生新的重組子。因此，4輪融合后的群體中，高達80% 的成員是經(jīng)過基因重組的。其中2.5%是充分重組的后代，即帶有來自4個不同親本的4個不同的遺傳標(biāo)記。另外的報道中，使用通過基因組混組的方法提高了乳桿菌的耐酸性能，其每輪融合的重組頻率為0.1%～1%[5]。而枯草芽胞桿菌原生質(zhì)體融合過程中重組頻率在 10?5的數(shù)量級，明顯低于上述二者。常規(guī)單輪融合后，重組的后代在后代群體中所占的比例很少，群體中的絕大多數(shù)成員仍然是親本類型。多輪融合過程中，重組的后代參加后一次融合獲得再次重組的機會很低。

循環(huán)融合的電子模擬結(jié)果同樣印證了這一點。單輪的重組頻率差一個數(shù)量級，帶有3個或者4個標(biāo)記的后代在多輪融合后所占的比例，就會差 2～3個數(shù)量級。因此，要達到充分的基因組混組，需要一種有能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細(xì)胞間高頻重組的操作技術(shù)作為基礎(chǔ)：循環(huán)融合中，不低于10?3～10?2的重組頻率應(yīng)該是進行有效混組的技術(shù)基礎(chǔ)。否則重組頻率較高的后代在群體中所占的頻率將會很低，從中篩到具有優(yōu)良性狀的后代會較為困難。

同時，本研究中引入了循環(huán)融合和循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)這兩種技術(shù)手段進行基因組混組。從循環(huán)轉(zhuǎn)化的結(jié)果來看，單輪轉(zhuǎn)化后除了產(chǎn)生帶有 2個遺傳標(biāo)記的后代外，同時也產(chǎn)生了帶有 3個遺傳標(biāo)記的后代。解釋為只要發(fā)生共轉(zhuǎn)化事件，即可實現(xiàn) 3個遺傳標(biāo)記集中于一個后代細(xì)胞。經(jīng)過多輪轉(zhuǎn)化后，重組細(xì)胞有所增加，3個遺傳標(biāo)記的后代在10?4數(shù)量級。循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果和循環(huán)轉(zhuǎn)化的結(jié)果類似，單輪轉(zhuǎn)導(dǎo)即可產(chǎn)生了帶有3個遺傳標(biāo)記的后代。多輪轉(zhuǎn)導(dǎo)后，3個遺傳標(biāo)記的后代也在 10?3數(shù)量級。其中，轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果后代所占比例總體上顯示增加的趨勢，但有一定的波動，分析可能的原因是部分細(xì)胞被噬菌體裂解影響到了總菌落計數(shù)?？偨Y(jié)起來，循環(huán)融合和循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)這兩種技術(shù)手段同樣無法實現(xiàn)高效的基因組混組。根據(jù)目前獲得的結(jié)果，尚無法對枯草芽胞桿菌 3種技術(shù)手段進行基因組混組的優(yōu)劣作出明確的結(jié)論。

如果使用轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)手段進行有效基因組混組，考慮其單輪引入的片段更短，所以對于轉(zhuǎn)化頻率或轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率要求會比循環(huán)融合更高一些，也不應(yīng)低于 10?3～10?2數(shù)量級。在關(guān)于多元自動化基因組工程 (Mupltiplexautomated genome engineering，MAGE) 技術(shù)的報道中，每一輪操作中可以使群體中30%以上的細(xì)胞獲得了新的遺傳修飾。由此推而廣之，包括多元自動化基因組工程、基因組混組在內(nèi)的多種基因組水平的菌種改造手段，可能都需要有一種技術(shù)手段，保證每一次操作后，群體中獲得修飾的成員在整體中所占的比例達到一定的水平，最終經(jīng)過多輪操作后才能得到多樣性較為豐富的突變庫，最終更容易從中篩選到性狀優(yōu)良的成員。

退一步講，根據(jù)本研究的結(jié)果，多輪實驗操作后，雖然重組子比例較低、基因組混組不充分，但也有一定程度的混組，已經(jīng)出現(xiàn)了帶有 3個篩選標(biāo)記的后代。如果擴大混組群體的規(guī)模，或者增加循環(huán)數(shù)，無篩選的條件下仍然有可能獲得充分混組、帶有 4個標(biāo)記的后代。如果后續(xù)有高效篩選方法，可以將群體中較低頻率出現(xiàn)的一些重組子有效地篩選出來。應(yīng)用于育種的過程，仍然有可能獲得性能提高的菌株。

如果在枯草桿菌的實驗技術(shù)上有突破，比如重組頻率可以大幅提高，那么多輪操作后基因組混組的效果同樣可以得到提高。原生質(zhì)體滅活法可以有效地提高篩選到優(yōu)良融合子的機率，并且用于紫杉醇生產(chǎn)菌樹狀多節(jié)孢菌Nodulisporium sylviform的基因組混組[16]。原生質(zhì)體融合前，首先以不同的方式滅活。滅活的過程中對原生質(zhì)體的某些方面造成了一定的損害，使其無法再生。不同的方法造成的損害是不同的，比如熱滅活主要是蛋白質(zhì)變性，紫外滅活主要是DNA損傷。因此，不同方法滅活后的原生質(zhì)體融合后可以相互互補損害，理論上只有融合子才可以再生。這樣減少了一些篩選工作，提高了篩選到優(yōu)良融合子的機率。新的融合技術(shù)的引入也可能解決重組頻率低的問題。李寰宇[17]和 Gong等[18]使用飛秒激光誘導(dǎo)紅法夫酵母Phaf fi a rhodozyma細(xì)胞融合，重組頻率達到80%以上。另外，一種新報道的融合方法是使用微觀流體設(shè)備直接捕獲原生質(zhì)體用于融合[19]。此種方法中用于融合的細(xì)胞是有導(dǎo)向的選擇，因此比其他方法有更高的融合效率。

REFERENCES

[1] Patnaik R. Engineering complex phenotypes in industrial strains.BiotechnolProg, 2008, 24(1): 38?47.

[2] Gong JX, Zheng HJ, Wu ZJ,et al. Genome shuf fl ing:progress and applications for phenotype improvement.Biotechnol Adv, 2009, 27(6): 996?1005.

[3] Chen T, Wang JY, Zhou SQ,et al. Trait improvement of riboflavin producingBacillus subtilisby genome shuffling and metabolic flux analysis.J Indust Engin Chem(China),2004, 55(11): 1842?1848.

陳濤, 王靖宇, 周世奇, 等. 基因組改組及代謝通量分析在產(chǎn)核黃素Bacillus subtilis性能改進中的應(yīng)用. 化工學(xué)報, 2004, 55(11): 1842?1848.

[4] Zhang YX, Perry K, Vinci VA,et al. Genome shuf fl ing leads to rapid phenotypic improvement in bacteria.Nature, 2002, 415(6872): 644?646.

[5] Patnaik R, Louie S, Gavrilovic V,et al. Genome shuf fl ing ofLactobacillusfor improved acid tolerance.Nat Biotechnol, 2002,20(7): 707?712.

[6] Liang HY, Guo Y. Whole Genome shuffling to enhance activity of fibrinolytic enzyme-producing strains.China Biotechnol, 2007, 27(10): 43.

梁惠儀, 郭勇. 全基因組重排育種技術(shù)提高豆豉纖溶酶菌產(chǎn)酶量. 中國生物工程雜志, 2007, 27(10): 43.

[7] Chen L, Chen WL. Genome shuf fl ing enhanced antagonistic activityagainstFusarium oxysporumf. sp.melonisand tolerance to chemical fungicidesinBacillus subtilisbs14.J Food Agri Environ, 2009, 7(2): 856?860.

[8] Hartl H, Wehrl W, Wiegert T,et al. Development of a new integration site within theBacillus subtilischromosome and constructionof compatible expression cassettes.J Bacteriol, 2001, 183(8): 2696?2699.

[9] Feucht A, Lewis PJ. Improved plasmid vectors for the production of multiple fl uorescent protein fusions inBacillus subtilis. Gene, 2001, 264(2): 289?297.

[10] Ziegler DR.BacillusGenetic Stock Center Catalog of Strains.7th ed. Columbus: Ohio State University Press, 2002.

[11] Zeigler DR, Prágai Z, Rodriguez S,et al. The origins of 168, w23, and otherBacillus subtilislegacy strains.J Bacteriol, 2008, 190(21): 6983?6995.

[12] Dedonder RA, Lepesant JA, Lepesant-Kejzlarová J,et al.Construction of a kit of reference strains for rapid genetic mapping inBacillus subtilis168.Appl Environ Microbiol,1977, 33(4): 989?993.

[13] Cutting SM, Vander Horn PB. Molecular biological methods forBacillus//Genetic Analysis. West Sussex:John Wiley, 1990: 27?74.

[14] Shi QQ, Wu SG. Industrial Microbial Breeding Science.3rd ed. Beijing: Science Press, 2009.

施巧琴, 吳松剛. 工業(yè)微生物育種學(xué). 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2009.

[15] Carlton BC. Transformation mapping of the genes controlling tryptophan biosynthesis inBacillus subtilis.J Bacteriol, 1967, 94(3): 660?665.

[16] Zhao K, Ping WX, Zhang LN,et al.Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling.Sci China C: Life Sci, 2008, 51(3): 222?231.

[17] Li HY, Gong JX, Xing QR,et al.Studies on femtosecond laser induced cell fusion.Chin J Lasers,2006, 33(12):1642.

李寰宇, 鞏繼賢, 邢岐榮, 等. 飛秒激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)的實驗研究. 中國激光, 2006, 33(12): 1642.

[18] Gong JX, Zhao XM, Xing QR,et al. Femtosecond laser-induced cell fusion.Applied Physics Lett, 2008,92(9): 093901-093901-3.

[19] Skelley AM, Kirak O, Suh HK. Micro fl uidic control of cell pairing and fusion.Nat Methods, 2009, 6(2): 147?152.

Genome shuffling method ofBacillus subtilis

Junjie Yang1,2, Wenchao Fan3, Han Xiao1, Chunhong Guan1, Chuanzeng Cao1,3, Haifeng Shao4,Weihong Jiang1, and Sheng Yang1,2,3

1Key Laboratory of Synthetic Biology,Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai200032,China
2Shanghai Research and Development Center of Industrial Biotechnology,Shanghai201201,China
3Huzhou Research Center of Industrial Biotechnology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Huzhou
313000,China
4Zhejiang Shunfeng Haider Co. Ltd.,Dongyang322100,China

Received:March 20, 2010;Accepted:June 7, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 30370022, 30570028), National Basic Research Program of China (973 Program)(No. 2007CB707803).

Corresponding author:Sheng Yang. +86-21-54924173; Fax: +86-21-54924015; E-mail: syang@sibs.ac.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 30370022, 30570028)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707803) 資助。