姜天翼，李理想，馬翠卿，許平

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100

2 上海交通大學(xué) 微生物代謝教育部重點實驗室，上海 200240

細(xì)胞工廠的優(yōu)化

微生物細(xì)胞工廠中多基因表達的控制策略

姜天翼1，李理想1，馬翠卿1，許平2

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100

2 上海交通大學(xué) 微生物代謝教育部重點實驗室，上海 200240

微生物代謝工程和合成生物學(xué)是當(dāng)今微生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點，微生物的生長速度快、容易進行大規(guī)模培養(yǎng)；遺傳背景清楚、遺傳操作簡便可靠等性質(zhì)使其在與人類生活相關(guān)的多個領(lǐng)域中起到重要的作用。微生物細(xì)胞工廠是指人工設(shè)計的能夠進行物質(zhì)生產(chǎn)的微生物代謝體系。許多微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建由于引入多個基因或整條代謝途徑，而可能導(dǎo)致代謝失衡、部分代謝中間產(chǎn)物積累等問題，需要使用一定的調(diào)控策略加以控制。以下對涉及多個基因作用的微生物細(xì)胞工廠中所使用的調(diào)控策略，分為若干層次進行了總結(jié)和探討，并對今后多基因控制策略的發(fā)展方向進行了預(yù)測與展望。

微生物細(xì)胞工廠，代謝工程，多基因表達，基因表達調(diào)控

Abstract:Microbial metabolic engineering and synthetic biology are important disciplines of microbial technology nowadays.Microbial cells are fast growing, easy to be cultivated in large scale, clear in genetic background and convenient in genetic modification. They play an important role in many domains. Microbial cell factory means an artificial microbial metabolic system that can be used in chemical production. The construction of a microbial cell factory needs transferring of multiple genes or a whole metabolic pathway, which may cause some problems such as metabolism imbalance and accumulation of mesostates. This review focuses on the regulation strategies of different levels involving simultaneous engagement of multiple genes. Future perspectives on the development of this domain were also discussed.

Keywords:microbial cell factory, metabolic engineering, expression of multiple genes, gene expression regulation

微生物是自然界中結(jié)構(gòu)最為簡單、研究最為深入，而應(yīng)用潛力十分巨大的物種。人類利用微生物進行工業(yè)生產(chǎn)具有悠久的歷史，其產(chǎn)物從傳統(tǒng)的酒、醋等食品已經(jīng)延伸到現(xiàn)在的燃料、醫(yī)藥、化工制品等與人類社會息息相關(guān)的各個領(lǐng)域。傳統(tǒng)的微生物應(yīng)用方法為從自然界中按照一定的要求直接篩選，或再通過誘變方法得到目的菌株或菌群即加以應(yīng)用。然而由于微生物的結(jié)構(gòu)簡單，其自身所擁有的生產(chǎn)能力往往達不到較好的應(yīng)用效果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物代謝工程應(yīng)運而生。1991年，Bailey JE將代謝工程定義為“采用重組DNA技術(shù)，操縱細(xì)胞的酶、運輸及調(diào)節(jié)功能，達到提高或改善細(xì)胞活性的目的”[1]。代謝工程為微生物“細(xì)胞工廠”繪制出了重要的藍圖[2]，微生物細(xì)胞逐漸被開發(fā)為一種“可編程的”裝置 (‘Programmable’entities)，其改造方法由單一的過表達或失活某種酶發(fā)展成為新式的、由工程設(shè)計所導(dǎo)向的對細(xì)胞組件進行整體規(guī)模上的改造，以及以簡單的組件為基礎(chǔ)構(gòu)建精細(xì)的代謝系統(tǒng)[3]。因此，在現(xiàn)代的細(xì)胞工廠構(gòu)建工程中，往往要引入多個基因甚至整套的代謝途徑，并要使其在宿主中最大化行使其功能。通過代謝工程構(gòu)建含多個外源基因的微生物細(xì)胞工廠已被應(yīng)用在多種物質(zhì)的生產(chǎn)中，如萜類化合物[4-5]、聚酮類化合物[6-8]、生物塑料制品[9]、非核糖體多肽[10]、聚合物模塊[11]等。

1 重組代謝途徑中多基因表達所存在的問題

雖然在微生物中構(gòu)建含有外源合成途徑的細(xì)胞工廠以生產(chǎn)復(fù)雜化合物及醫(yī)藥制品是一種替代化學(xué)合成方法的理想途徑，但這一方法還是存在著重大的缺陷：即在將較復(fù)雜的代謝途徑轉(zhuǎn)移的過程中，其原本的代謝流調(diào)控機制往往無法再發(fā)揮作用[5]。自然的代謝調(diào)控是一系列十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪^程 (如正、負(fù)反饋調(diào)節(jié))，在進化過程中往往會形成某種代謝物“恰到好處”的合成方式 (‘Just enough’synthesis)。然而，人工構(gòu)建合成途徑的代謝流量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過自然代謝途徑的代謝流量，過高的外源表達會與宿主本身的代謝過程競爭包括核苷酸、氨基酸在內(nèi)的各種資源，這些資源可能是宿主用于自身的增殖，甚至是目的產(chǎn)物的合成[12]。同時，過高的外源表達量會誘發(fā)宿主的一系列反應(yīng)，例如壓力反應(yīng) (Stress response)、嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng) (Stringent response)、熱激反應(yīng)(Heat shock response)等[13-15]，這些反應(yīng)會導(dǎo)致多種特殊基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞正常蛋白的合成，質(zhì)粒不穩(wěn)定、細(xì)胞的裂解和細(xì)胞遺傳信息的改變，并最終會導(dǎo)致構(gòu)建的細(xì)胞工廠無法按照預(yù)先設(shè)計的方式進行工作[16]。另一方面，引入外源代謝途徑雖然能夠移除某些限制代謝流量的調(diào)控位點，但其中各步酶反應(yīng)的代謝流量難以保持平衡，這種失衡也是影響總體生產(chǎn)能力的重要制約因素。某些中間代謝物，尤其是細(xì)胞毒性物質(zhì)的大量積累會嚴(yán)重影響宿主細(xì)胞正常的運轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)效率的下降[17]。為了避免上述一系列情況的發(fā)生，在細(xì)胞工廠的構(gòu)建過程中，對外源代謝途徑的總體流量以及各個酶反應(yīng)效率的平衡加以有效地控制是十分重要的。當(dāng)代的代謝工程研究已經(jīng)為協(xié)調(diào)多基因表達提供了多個層次的策略，包括轉(zhuǎn)錄水平的控制、翻譯水平的控制、以及使用一些特殊的附加裝置進行控制等[3,12]。

2 控制多基因表達的策略

2.1 針對DNA轉(zhuǎn)錄過程的控制策略

對轉(zhuǎn)錄過程的控制方法主要集中在對于啟動子的研究方面。協(xié)調(diào)多個外源基因表達最簡單、最直接的途徑是對不同的基因使用不同的誘導(dǎo)型啟動子，如使用Plac啟動子控制第 1個基因的表達，而用PBAD啟動子控制第2個基因的表達。Van Dien SJ等通過在大腸桿菌宿主中分別使用Ptac啟動子和PBAD啟動子控制編碼多磷酸鹽激酶 (PPK) 的基因和編碼多磷酸鹽酯酶 (PPX) 的基因，能夠在不同的培養(yǎng)時期添加相應(yīng)的誘導(dǎo)劑分別啟動 2個基因的表達。通過這一控制方法，該課題組對于微生物中磷酸鹽和能量的儲存以及多聚磷酸鹽的作用進行了深入的研究[18-19]。利用多個啟動子的方法雖然設(shè)計簡單，但是具有嚴(yán)重缺陷：首先，反應(yīng)體系需要添加多種誘導(dǎo)劑，在代謝途徑中設(shè)計的環(huán)節(jié)較多時，不可避免地會使用到價格昂貴的物質(zhì)，大大增加了生產(chǎn)成本；第二，較多的誘導(dǎo)劑添加過程會增加反應(yīng)過程的復(fù)雜性，從而降低細(xì)胞工廠體系生產(chǎn)中的穩(wěn)定性；第三，多種誘導(dǎo)劑的添加可能會引起交互作用 (Cross-talk)，限制了許多啟動子組合的應(yīng)用[20-21]。

基于上述缺點，研究者希望能夠通過一種誘導(dǎo)物質(zhì)同時誘導(dǎo)多個基因以不同的強度表達，最先被考慮到的方法是對啟動子進行改造。多種方法被應(yīng)用于對啟動子的篩選及人工改造。構(gòu)建啟動子庫是一種獲得多種使用相同誘導(dǎo)劑而強度不同的啟動子的有效方法，該方法也可被稱為“啟動子工程”，其理論基礎(chǔ)是保持調(diào)控蛋白結(jié)合位點序列不變，通過改變啟動子?10區(qū)和?35區(qū)的保守序列或者其間的若干個堿基，可將啟動子的強度調(diào)整至不同的水平[16]。Nevoigt等使用隨機突變構(gòu)建出一個釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的DAN1啟動子庫，并使用多級流式細(xì)胞術(shù)篩選出溶氧敏感性的啟動子，細(xì)胞在生長過程中對氧氣的消耗即可誘導(dǎo)啟動子的啟動[22]。對于啟動子?10和?35保守區(qū)堿基的突變會使啟動子的強度發(fā)生較大的變化，而對兩者之間堿基進行突變對啟動子強度的影響較小，適合于更加精細(xì)的對啟動子進行改造[23]。Jensen等通過保持保守序列不變，而隨機突變之間的分隔區(qū)域，構(gòu)建了乳酸乳球菌Lactococcus lactis中的啟動子庫，篩選得到了38個突變的啟動子，其啟動強度從0.3個單位到 2 000個單位不等。更值得注意的是，所獲得啟動子強度的增強并非跳躍式的，而是逐步升高[24]。通過構(gòu)建這一類啟動子庫，可以選擇合適的啟動子對不同蛋白質(zhì)的表達水平進行更加精細(xì)的控制，這對細(xì)胞工廠的設(shè)計將會起到重要的幫助作用。構(gòu)建啟動子庫的方法可以使細(xì)胞工廠體系中所有的基因由同一種誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)，并且不用顧及誘導(dǎo)劑的加量而使各個基因按照合適的水平進行表達。但是其構(gòu)建的過程往往較為困難，并且對于一條代謝途徑進行控制時，必須首先對各個步驟酶的活性進行復(fù)雜的優(yōu)化以確定選用何種強度的啟動子進行控制[20]。

除了針對啟動子的選擇和改造以外，還有其他的方法可以對轉(zhuǎn)錄過程進行控制。Khlebnikov 等通過添加可以獨立地對于誘導(dǎo)劑的運輸進行控制的基因，限制誘導(dǎo)劑進入細(xì)胞的過程，構(gòu)建了一套阿拉伯糖誘導(dǎo)的可調(diào)控表達系統(tǒng)[25]。使用外源的RNA聚合酶或者轉(zhuǎn)錄因子，同樣可以在單個細(xì)胞的水平對基因表達進行控制[20]。微生物基因組中的σ因子是RNA聚合酶的亞基之一，其變化可以改變啟動子對于RNA聚合酶的選擇性，影響轉(zhuǎn)錄水平，從而可以對轉(zhuǎn)錄組進行總體水平上的控制[26-28]。Stephanopoulos課題組通過隨機突變大腸桿菌中的σ70因子，同時改變了多個基因的調(diào)控并進行優(yōu)化，增加了外源構(gòu)建的番茄紅素生產(chǎn)途徑的代謝產(chǎn)量及宿主的抗逆性[29]。

2.2 針對mRNA翻譯過程的控制策略

傳統(tǒng)的在翻譯水平對于基因表達的控制是由突變核糖體結(jié)合位點以增強或減弱翻譯起始的水平實現(xiàn)的，而現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出更加先進的方法，包括使用人工的核酶、核糖開關(guān) (Riboswitch) 等感應(yīng)組件、人工構(gòu)建操縱子并改變操縱子基因間序列(Intergenic region)、構(gòu)建基因間序列庫等。

生物體中的許多mRNA含有一種稱為核糖開關(guān)的調(diào)控裝置，該裝置是一類具有復(fù)雜折疊結(jié)構(gòu)的RNA 結(jié)構(gòu)域，位于 mRNA 的 5′非翻譯區(qū) (5′Untranslated regions, 5′UTRs)，在其寡核苷酸適配子部分 (Aptamers) 與特定的小分子物質(zhì)結(jié)合的情況下，通過使mRNA發(fā)生某些結(jié)構(gòu)變化而影響mRNA翻譯的起始、延伸等過程，從而調(diào)節(jié)基因的表達水平[30]。相對于在特定蛋白的幫助下與mRNA結(jié)合的小RNA (MicroRNAs, miRNAs) 和干擾RNA (Short interfering RNAs, siRNAs) 調(diào)控方式，每一個核糖開關(guān)與一種特定的簡單物質(zhì) (抗生素、代謝產(chǎn)物等) 相應(yīng)的結(jié)合即可行使其功能，而不需要輔助蛋白質(zhì)參與這一調(diào)節(jié)過程[31]。并且，如果通過體外人工篩選獲得可識別細(xì)胞代謝物的適配子[32]，則可設(shè)計出根據(jù)細(xì)胞自身的代謝狀況調(diào)節(jié)基因表達的系統(tǒng)，故核糖開關(guān)被認(rèn)為能夠比啟動子更精確地調(diào)節(jié)基因表達和優(yōu)化代謝途徑[16]。在細(xì)胞工廠的設(shè)計方案中，可以通過添加人工構(gòu)建的核糖開關(guān)對基因的表達進行控制。人工構(gòu)建的核糖開關(guān)主要有通過插入適配子進行調(diào)控，通過促使 RNA螺旋移動的方式進行調(diào)控，通過反義RNA進行調(diào)控等幾種方式[31]。其中，人工選擇合適適配子插入mRNA的調(diào)控方法只有在真核細(xì)胞中的應(yīng)用報道，如哺乳動物細(xì)胞[33]、酵母[34-35]等，而在微生物中難以加以應(yīng)用。這是因為插入的適配子只有位于核糖體結(jié)合區(qū)域和翻譯起始密碼子之間才能發(fā)揮作用，而原核生物的核糖體結(jié)合位點 (SD序列) 與起始密碼子在空間上是緊密偶聯(lián)的，兩者之間的距離不能超過13個核苷酸。除非能夠篩選出新型的適配子，一般意義上的適配子無法插入到這么短的一段距離內(nèi)[31]。利用RNA螺旋移動的方式進行調(diào)控是一種原核細(xì)胞適用的調(diào)控策略，即在目標(biāo)mRNA的SD序列之前添加含雙結(jié)構(gòu)域的元件，阻礙核糖體小亞基與 SD序列結(jié)合，當(dāng)特定配體與適配子結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，會造成另一個結(jié)構(gòu)域——橋狀結(jié)構(gòu)域發(fā)生滑動，使該元件整體遠(yuǎn)離SD序列，核糖體得以結(jié)合上去，從而使翻譯起始[36]。反義RNA調(diào)控同樣可以在微生物中加以應(yīng)用，其方式是通過一小段人工插入的 RNA序列 1與原始mRNA的 SD序列形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，阻礙核糖體的結(jié)合，而通過另一小段額外轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA序列2高特異性地結(jié)合RNA序列1，可以解除其與SD序列的結(jié)合，頸環(huán)結(jié)構(gòu)消失，翻譯得以起始[37]。在細(xì)胞工廠的設(shè)計中，合理地加入不同類型的核糖開關(guān)組件，可以達到控制多個基因的差異水平表達的效果，甚至是與細(xì)胞代謝情況密切相關(guān)的表達控制。

在微生物中，多亞基蛋白或是一條代謝途徑中的多個酶通常位于一個由單個啟動子控制的操縱子中，而操縱子通過某些機制改變轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性或者翻譯起始能力，以協(xié)調(diào)這些基因的表達水平。這種調(diào)控方式為在mRNA水平上人工控制多基因差異水平表達提供了另一種思路，即將多個基因構(gòu)建在一個操縱子中，再對操縱子中基因間的序列進行改造，引入mRNA的二級結(jié)構(gòu)或者RNA酶作用位點等調(diào)整mRNA的性質(zhì)，從而影響基因的表達水平。該種方法可以在使用一個啟動子、一種誘導(dǎo)劑的作用下實現(xiàn)多種蛋白的差異水平表達。Keasling課題組對這種控制策略進行了較為系統(tǒng)的研究。該課題組在大腸桿菌宿主中嘗試使用經(jīng)過系統(tǒng)設(shè)計的操縱子基因間序列進行調(diào)控，將編碼綠色熒光蛋白的gfp基因和編碼半乳糖苷酶N端的lacZ基因依次置于一個操縱子中，而將兩段編碼區(qū)中間設(shè)計一段特殊的序列，在初始mRNA上5′端至3′端依次結(jié)構(gòu)為：gfp基因-發(fā)夾結(jié)構(gòu)-RNA 酶 E酶切位點-發(fā)夾結(jié)構(gòu)-lacZ基因-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其加工過程中該段序列會被RNA酶剪切為兩段單獨的 mRNA，而通過加入的發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響兩段 mRNA各自的穩(wěn)定性，使用不同的RNA酶E酶切位點以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可以將2種酶的酶活控制在不同的比例[38]。如果將2個編碼基因gfp和lacZ的位置互換，同時分別使用上述控制策略，能夠使兩者的酶活相差更大[39]。然而，上述方法也存在著缺陷。首先，同啟動子的誘導(dǎo)劑一樣，多種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控元件會有交互作用，如mRNA降解影響轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄狀況的變化又有可能加速mRNA的降解[40]；其次，上述方法只能將2個基因的相對活性控制在少數(shù)幾個固定的水平，因此在實際的代謝途徑構(gòu)建中難以設(shè)計出能將相對比例控制在合適水平的組件。為了克服這些缺陷，該課題組構(gòu)建了一個可調(diào)節(jié)基因間序列 (Tunable intergenic regions, TIGRs) 庫，通過PCR將4組寡核苷酸序列隨機組合，得到了 104個基因間序列，這些序列包括不同mRNA二級結(jié)構(gòu)、RNA酶剪切位點、核糖體結(jié)合位點抑制序列等的組合。再經(jīng)過轉(zhuǎn)化子篩選，得到的可調(diào)節(jié)基因間序列庫可以將2個基因編碼蛋白的活性比例在1∶1到1∶100的范圍內(nèi)改變。通過選擇合適的序列，他們優(yōu)化了在大腸桿菌中構(gòu)建的甲羥戊酸合成途徑，并成功地將其產(chǎn)量提高了7 倍[41]。

2.3 應(yīng)用支架蛋白質(zhì)的控制策略

在細(xì)胞工廠的構(gòu)建過程中，相比于基因水平上的改造，在蛋白質(zhì)層次上對于代謝途徑的平衡和控制較為困難，因為蛋白質(zhì)的定向進化或修飾是一項相當(dāng)復(fù)雜的工作，雖然具有理論上的可能性，比如通過改造調(diào)整代謝關(guān)鍵步驟酶的酶活，使構(gòu)建的代謝途徑達到平衡，但其實驗的設(shè)計、操作都具有較高的難度。而另一種針對蛋白質(zhì)的特殊調(diào)控策略研究正在逐漸開展起來，即使用人工合成的支架蛋白質(zhì) (Scaffold proteins) 對代謝途徑中的各個組件進行模塊化的控制 (Modular control)。支架蛋白本身是一種存在于生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的輔助蛋白，在空間上將該系統(tǒng)中的多個蛋白組織到一起，形成一個復(fù)合物[42-43]。Bashor等報道了使用酵母中改造的Ste5支架蛋白對酵母接合MAP激酶途徑進行調(diào)整，在自然狀態(tài)下，酵母中的Ste5支架蛋白將3個接合MAP激酶途徑中的蛋白整合在一起，而該工作在Ste5上額外添加了一個堿性亮氨酸拉鏈結(jié)合位點，再通過添加裝有酸性亮氨酸拉鏈的正/負(fù)調(diào)節(jié)劑(Modulators)，即可以將該途徑的代謝通量上調(diào)或者下調(diào)[44]。自然存在的支架蛋白質(zhì)只限應(yīng)用于其固有的信號途徑中，相應(yīng)的改造同樣應(yīng)用十分局限，但以其原理為基礎(chǔ)，也可以構(gòu)建出完全根據(jù)需要而人工設(shè)計的支架蛋白質(zhì)原件。Keasling課題組在該領(lǐng)域同樣有突出的貢獻，他們針對在大腸桿菌中構(gòu)建的甲羥戊酸代謝途徑設(shè)計了一個支架蛋白組件，該蛋白由3個不同的配基組成，而在該代謝途徑的3個酶上各添加一個相應(yīng)的配體，通過該支架的作用，可以將 3個酶同時固定在一個復(fù)合物中。如果將支架蛋白質(zhì)的 3個配基設(shè)定為不同的數(shù)量，則可以在同一支架上固定不同數(shù)量的 3種酶，以此可以調(diào)整 3個酶的數(shù)量的比值。該設(shè)計方案不僅可以優(yōu)化代謝途徑中多個酶的化學(xué)計量數(shù)比，平衡途徑中各個環(huán)節(jié)的流量，還可以縮短各個酶之間的空間距離，起到“底物通道”(Substrate channeling) 的效果，使中間代謝產(chǎn)物傳遞距離更短，與細(xì)胞環(huán)境的接觸更少而避免擴散和降解。在這些特點共同的作用下，甲羥戊酸的產(chǎn)量成功地提高了 77倍[12]。人工設(shè)計的支架蛋白質(zhì)對于多基因表達的控制雖然精密、高效、應(yīng)用范圍廣，但是其設(shè)計和實施同樣較為復(fù)雜，實施的難度較高，目前類似的工作報道很少。

圖1 微生物細(xì)胞工廠中多基因表達調(diào)控方式總覽[12,20]Fig.1 Overview of the regulation strategies for multiple genes expression in microbial cell factory[12,20].

3 結(jié)論與展望

微生物細(xì)胞工廠的設(shè)計是精細(xì)而復(fù)雜的，然而隨著代謝工程、合成生物學(xué)等相關(guān)研究工作的不斷深入，已經(jīng)為這項工作提供了越來越多的服務(wù)平臺。各種文庫如啟動子文庫、核糖開關(guān)文庫、基因間序列文庫等的構(gòu)建極大地方便了對于多基因的控制，設(shè)計者只需要選擇合適的元件組合到目標(biāo)外源代謝途徑中，即可以平衡各個基因的表達水平，甚至精確地控制各個酶數(shù)量和活性的相對值。目前，研究者進一步認(rèn)識到，除了自身的平衡問題以外，一條外源代謝途徑的植入會在代謝網(wǎng)絡(luò)的層次上對宿主菌株產(chǎn)生許多干擾[45]，而以生物信息學(xué)、基因芯片技術(shù)、功能基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等為輔助，解決工程菌株整體代謝網(wǎng)絡(luò)中存在的問題，構(gòu)建更加高效和復(fù)雜的細(xì)胞工廠系統(tǒng)已經(jīng)成為研究的新熱點，對于多基因代謝途徑控制的研究已逐漸從模塊化的組件水平上升至完整的系統(tǒng)水平。計算機輔助工具以及專用代謝模擬工具的出現(xiàn)和完善將會進一步為含有多個外源基因細(xì)胞工廠體系的設(shè)計提供強有力的支持，但是相關(guān)的開發(fā)工作仍處于起步階段，并且難度較大。因為微生物細(xì)胞即使相對于自然界中其他的生命體系較為簡單，其對于計算機編程來說仍然還是一個十分復(fù)雜的系統(tǒng)。一個可行的方向是構(gòu)建只含有最小基因組(Minimal genome)[46]的宿主菌株，最大程度地減少宿主本身代謝的復(fù)雜性，簡化計算機模擬程序的設(shè)計。相信在不久的將來，將有越來越多設(shè)計精密、含有更多更復(fù)雜的基因而控制又更加方便的細(xì)胞工廠系統(tǒng)，能夠為人類社會作出巨大的貢獻。

REFERENCES

[1] Bailey JE. Toward a science of metabolic engineering.Science, 1991, 252(5013): 1668?1675.

[2] Li Y, Cao ZA. Microbial metabolic engineering: gateway to develop blueprints for cell factories.CIESC J, 2004,55(10): 1573?1580.

李寅, 曹竹安. 微生物代謝工程: 繪制細(xì)胞工廠的藍圖.化工學(xué)報, 2004, 55(10): 1573?1580.

[3] Purnick PE, Weiss R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems.Nat Rev Mol Cell Biol,2009, 10(6): 410?422.

[4] Martin VJ, Pitera DJ, Withers ST,et al. Engineering a mevalonate pathway inEscherichia colifor production of terpenoids.Nat Biotechnol, 2003, 21(7): 796?802.

[5] Pitera DJ, Paddon CJ, Newman JD,et al. Balancing a heterologous mevalonate pathway for improved isoprenoid production inEscherichia coli.Metab Eng, 2007, 9(2):193?207.

[6] Peiru S, Menzella HG, Rodriguez E,et al. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C inEscherichia coli.Appl Environ Microbiol, 2005, 71(5):2539?2547.

[7] Murli S, Kennedy J, Dayem LC,et al. Metabolic engineering ofEscherichiacolifor improved 6-deoxyerythronolide B production.J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30(8): 500?509.

[8] Pfeifer BA, Admiraal SJ, Gramajo H,et al. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain ofE. coli.Science, 2001, 291(5509): 1790?1792.

[9] Aldor IS, Keasling JD. Process design for microbial plastic factories: metabolic engineering of polyhydroxyalkanoates.Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(5): 475?483.

[10] Watts KT, Mijts BN, Schmidt-Dannert C. Current and emerging approaches for natural product biosynthesis in microbial cells.Adv Synth Catal, 2005, 347(7/8): 927?940.

[11] Nakamura CE, Whited GM. Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol.Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(5): 454?459.

[12] Dueber JE, Wu GC, Malmirchegini GR,et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.Nat Biotechnol, 2009, 27(8): 753?759.

[13] Wick LM, Egli T. Molecular components of physiological stress responses inEscherichia coli.Adv Biochem Eng Biotechnol, 2004, 89: 1?45.

[14] Harcum SW, Bentley WE. Heat-shock and stringent responses have overlapping protease activity inEscherichia coli. implications for heterologous protein yield.Appl Biochem Biotechnol, 1999, 80(1): 23?37.

[15] Gill RT, Valdes JJ, Bentley WE. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins inEscherichia coli.Metab Eng,2000, 2(3): 178?189.

[16] Wang JS, Qi QS. Synthetic biology for metabolic engineering-a review.Chin J Biotech, 2009, 25(9):1296?1302.

王俊姝, 祁慶生. 合成生物學(xué)與代謝工程. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(9): 1296?1302.

[17] Zhu MM, Lawman PD, Cameron DC. Improving 1,3-propanediol production from glycerol in a metabolically engineeredEscherichia coliby reducing accumulation ofsn-glycerol-3-phosphate.Biotechnol Prog, 2002, 18(4): 694?699.

[18] Van Dien SJ, Keasling JD. Optimization of polyphosphate degradation and phosphate secretion using hybrid metabolic pathways and engineered host strains.Biotechnol Bioeng, 1998, 59(6): 754?761.

[19] Van Dien SJ, Keyhani S, Yang C,et al. Manipulation of independent synthesis and degradation of polyphosphate inEscherichia colifor investigation of phosphate secretion from the cell.Appl Environ Microbiol, 1997,63(5): 1689?1695.

[20] Keasling JD. Synthetic biology for synthetic chemistry.ACS Chem Biol, 2008, 3(1): 64?76.

[21] Lee SK, Chou HH, Pfleger BF,et al. Directed evolution of AraC for improved compatibility of arabinose- and lactose-inducible promoters.Appl Environ Microbiol,2007, 73(18): 5711?5715.

[22] Nevoigt E, Fischer C, Mucha O,et al. Engineering promoter regulation.Biotechnol Bioeng, 2007, 96(3):550?558.

[23] Jensen PR, Hammer K. Artificial promoters for metabolic optimization.Biotechnol Bioeng, 1998, 58(2/3): 191?195.

[24] Jensen PR, Hammer K. The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters.Appl Environ Microbiol, 1998,64(1): 82?87.

[25] Khlebnikov A, Risa O, Skaug T,et al. Regulatable arabinose-inducible gene expression system with consistent control in all cells of a culture.J Bacteriol,2000, 182(24): 7029?7034.

[26] Owens JT, Miyake R, Murakami K,et al. Mapping the sigma70subunit contact sites onEscherichia coliRNA polymerase with a sigma70-conjugated chemical protease.Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(11): 6021?6026.

[27] Siegele DA, Hu JC, Walter WA,et al. Altered promoter recognition by mutant forms of the sigma 70subunit ofEscherichia coliRNA polymerase.J Mol Biol, 1989,206(4): 591?603.

[28] Gardella T, Moyle H, Susskind MM. A mutantEscherichia colisigma 70subunit of RNA polymerase with altered promoter specificity.J Mol Biol, 1989,206(4): 579?590.

[29] Alper H, Stephanopoulos G. Global transcription machinery engineering: a new approach for improving cellular phenotype.Metab Eng, 2007, 9(3): 258?267.

[30] Mandal M, Breaker RR. Gene regulation by riboswitches.Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5(6): 451?463.

[31] Bauer G, Suess B. Engineered riboswitches as novel tools in molecular biology.J Biotechnol, 2006, 124(1): 4?11.

[32] Bayer TS, Smolke CD. Programmable ligand-controlled riboregulators of eukaryotic gene expression.Nat Biotechnol, 2005, 23(3): 337?343.

[33] Werstuck G, Green MR. Controlling gene expression in living cells through small molecule-RNA interactions.Science, 1998, 282(5387): 296?298.

[34] Grate D, Wilson C. Inducible regulation of theS.cerevisiaecell cycle mediated by an RNA aptamer-ligand complex.Bioorg Med Chem, 2001, 9(10): 2565?2570.

[35] Berens C, Thain A, Schroeder R. A tetracycline-binding RNA aptamer.Bioorg Med Chem, 2001, 9(10):2549?2556.

[36] Suess B, Fink B, Berens C,et al. A theophylline responsive riboswitch based on helix slipping controls gene expressionin vivo.Nucleic Acids Res, 2004, 32(4):1610?1614.

[37] Isaacs FJ, Dwyer DJ, Ding C,et al. Engineered riboregulators enable post-transcriptional control of gene expression.Nat Biotechnol, 2004, 22(7): 841?847.

[38] Smolke CD, Carrier TA, Keasling JD. Coordinated,differential expression of two genes through directed mRNA cleavage and stabilization by secondary structures.Appl Environ Microbiol, 2000, 66(12): 5399?5405.

[39] Smolke CD, Keasling JD. Effect of gene location, mRNA secondary structures, and RNase sites on expression of two genes in an engineered operon.Biotechnol Bioeng,2002, 80(7): 762?776.

[40] Deana A, Belasco JG. Lost in translation: the influence of ribosomes on bacterial mRNA decay.Genes Dev, 2005,19(21): 2526?2533.

[41] Pfleger BF, Pitera DJ, Smolke CD,et al. Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes.Nat Biotechnol, 2006, 24(8):1027?1032.

[42] Pawson T, Scott JD. Signaling through scaffold,anchoring, and adaptor proteins.Science, 1997, 278(5346):2075?2080.

[43] Burack WR, Shaw AS. Signal transduction: hanging on a scaffold.Curr Opin Cell Biol, 2000, 12(2): 211?216.

[44] Bashor CJ, Helman NC, Yan S,et al. Using engineered scaffold interactions to reshape MAP kinase pathway signaling dynamics.Science, 2008, 319(5869): 1539?1543.

[45] Kizer L, Pitera DJ, Pfleger BF,et al. Application of functional genomics to pathway optimization for increased isoprenoid production.Appl Environ Microbiol, 2008,74(10): 3229?3241.

[46] Posfai G, Plunkett GR, Feher T,et al. Emergent properties of reduced-genomeEscherichia coli.Science, 2006,312(5776): 1044?1046.

Strategies for regulating multiple genes in microbial cell factories

Tianyi Jiang1, Lixiang Li1, Cuiqing Ma1, and Ping Xu2

1State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan250100,China
2MOE Key Laboratory of Microbial Metabolism,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai200240,China

Received:May 24, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30770064), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2007CB707803).

Corresponding author:Cuiqing Ma. Tel: +86-531-88364003; Fax: +86-531-88369463; E-mail: macq@sdu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 30770064)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707803) 資助。