董紅軍，張延平，李寅

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

細(xì)胞工廠的構(gòu)建技術(shù)

丙酮丁醇梭菌的遺傳操作系統(tǒng)

董紅軍，張延平，李寅

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

丙酮丁醇梭菌是極具潛力的替代燃料——生物丁醇的合成菌，受到各國研究者的普遍關(guān)注。丙酮丁醇梭菌菌株改造是生物丁醇產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的一項重要工作，其中遺傳操作是核心內(nèi)容之一。以下對丙酮丁醇梭菌的遺傳操作系統(tǒng)的發(fā)展歷史、種類和原理進(jìn)行了綜述，分析了目前幾種遺傳操作系統(tǒng)的局限性，并對其發(fā)展進(jìn)行了展望。

丙酮丁醇梭菌，丁醇，菌株改造，遺傳操作系統(tǒng)

Abstract:Clostridium acetobutylicum, a biofuel-butanol producer, has attracted worldwide interests. Strain improvement is important for the process of biobutanol industrialization where efficient genetic modification systems are essential. In this review,the history of genetic modification systems ofC. acetobutylicumwas introduced, and the types and principles of these systems and their disadvantages are summarized and analysed. The development of updated genetic modification systems forC. acetobutylicumis also proposed.

Keywords:Clostridium acetobutylicum, butanol, strain improvement, genetic modification systems

丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，全球年需求量超過140萬t。丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)；含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會腐蝕管道、不易吸水，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且與汽油有很好的混合性。

生產(chǎn)丁醇有兩種方式，一種是通過化工方法從石油中提煉。這種方法是目前市場上丁醇的主要來源。但隨著石油作為不可再生資源，儲備量急劇減少，且價格節(jié)節(jié)攀高，生物法生產(chǎn)丁醇作為石化法生產(chǎn)的替代方式受到越來越多的關(guān)注。產(chǎn)丁醇的微生物包括丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum、拜氏梭菌C. beijerinckii、C. saccharoperbutylacetonicum和C. saccharobutylicum等菌株，其中對丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum的研究最廣泛和深入。微生物生產(chǎn)丁醇的主要問題是產(chǎn)物濃度低、產(chǎn)率低、分離成本高，因此生物丁醇的生產(chǎn)需要對現(xiàn)有的發(fā)酵體系及菌株進(jìn)行改造，才有可能滿足工業(yè)化需求。傳統(tǒng)的菌株改造是基于誘變的隨機(jī)篩選，工作量大，而且經(jīng)過過去長期誘變篩選，其提升丁醇生產(chǎn)能力的空間已經(jīng)很小。2001年丙酮丁醇梭菌基因組的測序完成[1]，為研究者們對丁醇生產(chǎn)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)的研究提供了可能。現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)[2]、蛋白組學(xué)[3]、代謝網(wǎng)絡(luò)模型[4-6]等方面都有廣泛的研究報道。雖然現(xiàn)在對丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的認(rèn)識已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但是通過菌株改造來提升丁醇生產(chǎn)能力的工作卻進(jìn)展不大。主要原因是由于厭氧梭菌的遺傳操作比較困難，轉(zhuǎn)化效率低 (103～105轉(zhuǎn)化子/μg DNA)[7]，傳統(tǒng)的同源重組方法難以進(jìn)行。雖然目前已經(jīng)有梭菌遺傳操作成功的報道，但是往往效率不高或使用范圍受限，遺傳操作工具的高效性仍是目前產(chǎn)丁醇菌株改造的一個制約因素。本文主要以丙酮丁醇梭菌模式菌株ATCC824為介紹對象，對其遺傳操作系統(tǒng)的發(fā)展歷史及原理進(jìn)行了總結(jié)，分析了其局限性，并對未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 丙酮丁醇梭菌的轉(zhuǎn)化

由于丙酮丁醇梭菌不具備自然轉(zhuǎn)化的能力，所以將外源 DNA導(dǎo)入到梭菌細(xì)胞內(nèi)就需要采取物理或化學(xué)的方法。Truffaut等[8]利用制備原生質(zhì)體的方法對丙酮丁醇梭菌 NI-4081菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，其方法是在含蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，待生長到一定階段后利用溶菌酶和青霉素G去除細(xì)胞壁，然后在聚乙二醇溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。但原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體再生過程比較復(fù)雜、耗時，目前比較常用的仍是操作簡單的電轉(zhuǎn)化方法。電轉(zhuǎn)化法是指細(xì)胞在瞬間的高壓電場中，細(xì)胞膜可以形成空隙，從而使得外源DNA進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。Mermelstein等使用的方法[7]是目前最為通用的方法，其主要內(nèi)容為使用ETB溶液 (272 mmol/L蔗糖溶液 (pH 7.4)，5 mmol/L NaH2PO4) 作為電轉(zhuǎn)溶液，電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓25 kV，電容25 μF，電阻∞，電擊杯0.4 cm，轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)105個轉(zhuǎn)化子/μg DNA。由于丙酮丁醇梭菌是嚴(yán)格的厭氧菌，所以制備感受態(tài)細(xì)胞的過程是在厭氧條件下 (厭氧箱內(nèi)) 完成的，目前還沒有在有氧條件下成功轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌的報道。

Tyurin等利用特制的電轉(zhuǎn)儀對丙酮丁醇梭菌進(jìn)行了方波高壓脈沖 (電壓 12 kV; 脈沖持續(xù)時間為22.5 ms，脈沖頻率100 kHz) 電轉(zhuǎn)化[9]，使得梭菌的轉(zhuǎn)化效率超過106個轉(zhuǎn)化子/μg DNA，是目前報道的最高轉(zhuǎn)化效率，然而由于這種特制的電轉(zhuǎn)儀還沒有商業(yè)化，所以研究丙酮丁醇梭菌通常使用的還是Mermelstein等的方法[7]。

限制修飾系統(tǒng) (Restriction-modification system)是自然界很多細(xì)菌中存在的一種細(xì)菌免疫系統(tǒng)，用于降解入侵的外源 DNA，保護(hù)自身 DNA。在丙酮丁醇梭菌的模式菌株 ATCC824中也存在著一種名為 Cac824I的二型限制修飾系統(tǒng)，識別-GCNGC-位點。大多數(shù)來自大腸桿菌的質(zhì)粒由于這個位點上沒有甲基化保護(hù)且具有多個拷貝，所以這樣的質(zhì)粒是不能夠轉(zhuǎn)化梭菌的。Mermelstein等利用表達(dá)有來自枯草芽胞桿菌噬菌體Ф3tI甲基化酶的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒的甲基化修飾，第一次實現(xiàn)了來自大腸桿菌的質(zhì)粒的成功轉(zhuǎn)化[7,10]。作者根據(jù)發(fā)表的丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因組信息及REBASE網(wǎng)站的預(yù)測，選擇CAC1502基因，利用二型內(nèi)含子的方法對其進(jìn)行了失活，得到的突變體菌株SMB009轉(zhuǎn)化時質(zhì)粒不再需要特異的甲基化修飾[11]。在丙酮丁醇梭菌中，限制修飾系統(tǒng)可能是不能利用接合方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移 (Gene transfer) 的一個關(guān)鍵因素，SMB009菌株將可能實現(xiàn)梭菌的接合操作。

2 丙酮丁醇梭菌中的復(fù)制型質(zhì)粒及表達(dá)質(zhì)粒

1989年，Truffaut等最早證明了pIM13、pT127、pBC16可以通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Clostridium acetobutylicumN1-4081中[12]，并構(gòu)建了E. coli-C.acetobutylicum穿梭型質(zhì)粒，Azeddoug等也利用pIM13構(gòu)建了新的穿梭載體，使用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化[13]。1990年 Williams等把來自pAMβ1 (Enterococcus faecalis)、pCB101 (C. butyricum)、pWV01 (Streptococcus cremoris) 的復(fù)制子與RK2型oriT片段相連接，構(gòu)建成可接合的穿梭型質(zhì)粒，首次成功地利用了 IncP型質(zhì)粒的接合原理，將質(zhì)粒導(dǎo)入C. acetobutylicumNCIB 8052 (現(xiàn)定名為C. beijerinckiiNCIMB 8052)中[14]。但是對于其他的丙酮丁醇梭菌如ATCC824、DSM1731、DSM792等均未見有利用接合方法導(dǎo)入質(zhì)粒的報道，所以這種方法可能只適用于C. beijerinckii。上述復(fù)制型質(zhì)粒都是來自非梭菌的菌株，1990年Yoshino等首次將分離自C. acetobutylicumstrain No. 86的質(zhì)粒pCS86(3.0 kb) 改造成了可與E. coli穿梭的質(zhì)粒，成功轉(zhuǎn)化了不含質(zhì)粒的C. acetobutylicumstrain No. 220[15]。1992年Lee等利用來自鏈球菌的質(zhì)粒pMU1328，來自丁酸梭菌的pCBU2，來自C. perfringens的pJC4、pJU22，來自Streptococcus faecalis的pAMβ1，來自Bacillus subtilis的 pIM13質(zhì)粒構(gòu)建了 pSYL2、pSYL7、pSYL9、pSYL14四個穿梭質(zhì)粒，由于ATCC824中限制修飾系統(tǒng)的限制，只有pSYL2可以成功轉(zhuǎn)化，而這 4個質(zhì)粒都可以以 8×102～6×103個轉(zhuǎn)化子/μg DNA的效率轉(zhuǎn)化NCIMB8052[16]。目前在ATCC824菌株使用的大多數(shù)質(zhì)粒是衍生自pIM13或pAMβ1。

3 丙酮丁醇梭菌中的基因失活策略

基于 Mermelstein等報道的丙酮丁醇梭菌電轉(zhuǎn)化方法[7]，Green等首次利用自殺質(zhì)粒成功地在梭菌中實現(xiàn)了基因敲除[17]。然而由于梭菌的轉(zhuǎn)化效率較低，利用自殺質(zhì)粒進(jìn)行同源重組的成功率極低，所以后來發(fā)展出了以復(fù)制型質(zhì)粒為基礎(chǔ)的反義 RNA抑制、復(fù)制型質(zhì)粒同源重組及二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)。2010年作者構(gòu)建的限制修飾系統(tǒng)缺陷型菌株SMB009使得這些操作都可以使用非甲基化的DNA來進(jìn)行。丙酮丁醇梭菌遺傳操作系統(tǒng)發(fā)展歷史上的重要事件總結(jié)見圖1。

圖1 丙酮丁醇梭菌的遺傳操作系統(tǒng)發(fā)展歷史Fig.1 History of genetic modification systems ofClostridium acetobutylicum.

3.1 基于非復(fù)制型質(zhì)粒的同源重組

Green和Bennett使用電轉(zhuǎn)化方法將非復(fù)制型質(zhì)粒導(dǎo)入到C. acetobutylicum中，通過同源重組單交換方法將丁酸激酶基因buk、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因pta、醇/醛脫氫酶基因aad、調(diào)控因子編碼基因solR成功敲除[17-19]。由于該方法成功率較低，在過去十多年的發(fā)展中，使用非復(fù)制型質(zhì)粒通過同源交換的方法敲除基因的成功例子只有這幾個。

3.2 基于復(fù)制型質(zhì)粒的同源重組

由于自殺質(zhì)粒同源重組的低效率，有研究者開發(fā)出了復(fù)制型質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除的方法。這種方法理論上將會比較容易得到突變體，因為含同源片段的質(zhì)粒可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，可以在幾代中存在，這樣就增加了同源交換片段間接觸的頻率和時間。pLHKO即是應(yīng)用于梭菌的這樣一個質(zhì)粒[20]，它含氯霉素抗性基因，有來自pIM13的復(fù)制子保證其在梭菌內(nèi)的復(fù)制。在實際應(yīng)用中，將目的基因兩側(cè)的同源片段連入載體，中間再引入一個紅霉素抗性基因，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌體。得到的陽性轉(zhuǎn)化子在無抗平板上培養(yǎng)，通過印模的方法連續(xù)轉(zhuǎn)板幾次，最后將其轉(zhuǎn)印到只含紅霉素的平板上篩選，得到的紅霉素抗性克隆再進(jìn)行驗證。spo0A基因的敲除是成功使用這種方法的例子[20]。

Soucaille等在2006年對基于復(fù)制型質(zhì)粒的同源重組的方法在梭菌中應(yīng)用申請了專利[21]，并在質(zhì)粒上引入了負(fù)篩選Marker尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(由upp基因編碼，其存在可使菌體對5-氟尿嘧啶敏感) 用于雙交換的篩選。Heap等在 2009年申請的專利中對復(fù)制型質(zhì)粒同源重組方法引入了新的策略[22]：在同源片段后面連入一段不含啟動子的抗性基因，當(dāng)質(zhì)粒呈游離狀態(tài)時，該抗性基因不表達(dá)，當(dāng)質(zhì)粒通過同源重組整合到染色體上時，該抗性可以利用靶基因的啟動子表達(dá)自身，從而表現(xiàn)出抗性(圖2)。由于前面介紹的復(fù)制型質(zhì)粒同源重組方法篩選整合子時，需要篩選大量的克隆，工作量很大，這個策略可以有效地解決這個問題。

3.3 反義RNA技術(shù)

Desai和Papoutsakis嘗試使用了反義RNA技術(shù)對菌株進(jìn)行代謝改造。他們針對buk和ptb的mRNA的靶點設(shè)計了 2個反義 RNA表達(dá)載體 pRD4和pRD1，結(jié)果使得含pRD4的菌株中丁酸激酶酶活下降85%，丁醇和丙酮的產(chǎn)量分別上升50%和30%。含pRD1的菌株中磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶活性下降70%，同時丙酮和丁醇產(chǎn)量下降96%和75%。這與buk基因敲除菌株得到的結(jié)果和推論相符[23]。Tummala利用反義RNA技術(shù)下調(diào)了丙酮途徑中的adc和ctfA/B的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然靶標(biāo)酶的酶活都有下降，但是adc的下調(diào)不影響丙酮的形成。下調(diào)ctfA/B卻可使丙酮和丁醇的產(chǎn)量明顯下降。這說明丙酮途徑中adc不是關(guān)鍵的，而ctfA/B是關(guān)鍵基因[24]。

3.4 二型內(nèi)含子基因失活技術(shù)

2007年有研究者發(fā)展了一種適用于梭菌的內(nèi)含子插入失活方法。內(nèi)含子插入法失活基因的主要原理是來自乳酸菌的ltrB基因的II型內(nèi)含子在特定宿主中由宿主啟動子表達(dá)，并從mRNA前體自剪接下來，形成特定結(jié)構(gòu)的 RNA，在多功酶蛋白 LtrA的輔助下，可以識別DNA上特定的序列，并且插入到特定的位點中，通過反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)鏈，最終以雙鏈形式插入到特定的DNA序列中 (圖3)。由于內(nèi)含子插入DNA的識別位點主要由內(nèi)含子的EBS1d和EBS2兩個位置的短序列來識別，因此根據(jù)一定的機(jī)制和算法改造內(nèi)含子，則內(nèi)含子就會識別特定的位點[25]。英國 Nottingham大學(xué) Minton教授領(lǐng)導(dǎo)的研究組和中國科學(xué)院上海植物生理研究所姜衛(wèi)紅研究組都基于這種原理開發(fā)出了適合梭菌中使用的內(nèi)含子插入型基因失活質(zhì)粒[26-27]。研究者們已經(jīng)使用這種方法成功敲除了buk、spo0A等基因。作者對Minton開發(fā)出的Clostron系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，構(gòu)建出了pMTL008和pMTL099載體[11]。目前已報道的二型內(nèi)含子載體特點見表 1。特定位點插入內(nèi)含子的設(shè)計是基于一種特定的算法，這個方法目前已被Sigma-Aldrich公司商品化，并且只有購買其產(chǎn)品時才有限定次數(shù)的使用權(quán)。另外由于內(nèi)含子的插入識別機(jī)理目前還沒完全得到解析，現(xiàn)在所認(rèn)識到的規(guī)律是結(jié)合一些統(tǒng)計學(xué)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測而得到的，所以內(nèi)含子會以一定的概率插入到非靶位點。染色體DNA的插入位點也要符合特定的結(jié)構(gòu)要求才能使得內(nèi)含子能夠插入，因此對于任意DNA位點的操作有一定限制。這種方法目前主要用于基因的插入型失活，對于缺失型失活不太適合或是比較麻煩。

圖2 Heap法基因敲除策略示意圖Fig.2 Heap strategy for gene knockout.

表1 四種二型內(nèi)含子載體特點比較Table 1 Characteristics of four vectors bearing group II intron

圖3ltrB二型內(nèi)含子基因敲除策略示意圖Fig.3 The process of gene knockout usingltrBgroup II intron.

4 展望

目前，多種適用于丙酮丁醇梭菌的遺傳操作方法已經(jīng)被開發(fā)出來，使得研究者能夠進(jìn)行在梭菌細(xì)胞中進(jìn)行遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究和菌株改造工作。然而，這些遺傳操作方法也同時存在著不同的局限性 (表2)。由于丙酮丁醇梭菌的轉(zhuǎn)化效率不高，所以利用非復(fù)制型質(zhì)粒進(jìn)行同源重組的成功率非常低，而利用復(fù)制型質(zhì)粒進(jìn)行同源重組的方法雖然增加了載體上同源片段與染色體上的同源片段的交換機(jī)會，但是篩選時的工作量比較大。Heap的方法是解決這種篩選時大工作量的一個好方法，然而，它不適用于那些在篩選條件下弱表達(dá)或不表達(dá)的基因。反義RNA技術(shù)已被成功應(yīng)用于梭菌中一些基因的下調(diào)表達(dá)，但是它的下調(diào)程度是不容易控制的，而且利用該方法很難實現(xiàn)完全失活某個基因。二型內(nèi)含子法是目前梭菌中最為有效的基因敲除方法，但是它的特點是插入位點滿足一定的堿基組成才能夠被插入，所以對于一些不含這樣的插入位點的基因是不適用的，另外內(nèi)含子插入位點識別算法是基于大腸桿菌的識別序列統(tǒng)計出來的，對于梭菌可能還需要一定的調(diào)整，且1個內(nèi)含子可能識別多個插入識別位點，所以有時不能確保準(zhǔn)確插入到靶位點中。

表2 現(xiàn)有丙酮丁醇梭菌中遺傳操作系統(tǒng)局限性分析Table 2 The disadvantages of current genetic modification systems ofC. acetobutylicum

基于以上的分析，我們認(rèn)為丙酮丁醇梭菌的遺 傳操作系統(tǒng)還有很大的提升空間，主要包括以下幾個方面：第一，提高轉(zhuǎn)化效率。對于基于非復(fù)制型質(zhì)粒的同源重組方法，需要配合高效的轉(zhuǎn)化方法才可能得以實現(xiàn)，所以提高轉(zhuǎn)化效率是該方法的突破口。開發(fā)梭菌在空氣中 (非厭氧條件) 進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法將會有利于簡化操作，并且可以使得大規(guī)模的優(yōu)化操作或特殊儀器的使用提供條件。第二，發(fā)展新策略。對于目前轉(zhuǎn)化效率不高的情況下，復(fù)制型質(zhì)粒的同源重組方法應(yīng)該是最有潛力的方法，對于雙交換而言，Heap法解決了第一步交換的篩選問題，Soucaille法解決第二步交換的篩選問題，那么兩種方法的結(jié)合將會是一種理想的敲除策略。第三，引入成熟的方法。將在大腸桿菌或是芽胞桿菌等模式生物中發(fā)展起來的方法或策略 (如基于lambda噬菌體Red重組酶的重組工程) 應(yīng)用到丙酮丁醇梭菌中，將會實現(xiàn)梭菌的高效遺傳操作。

致謝：感謝中國科學(xué)院微生物研究所的朱巖幫助繪制圖3。

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Genetic modification systems forClostridiumacetobutylicum

Hongjun Dong, Yanping Zhang, and Yin Li

Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Received:June 15, 2010;Accepted:August 15, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA02Z237).

Corresponding author:Yin Li. Tel/Fax: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA02Z237) 資助。